肝素和硫酸乙酰肝素的功能

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肝素和硫酸乙酰肝素的功能

Rabenstein D L

内源肝素在肥大细胞内，是肥大细胞分泌颗粒的主要组成成分。内源肝素在医学上作为抗凝血剂使用，并在预防和治疗血栓栓塞疾病中被作为首选药物。硫酸乙酰肝素（HS）在动物组织中广泛存在并且结构多样，同样也具有多种生物活性和功能，包括细胞黏附、调控细胞生长和增殖、发育过程和血液凝固、细胞表面结合脂蛋白脂肪酶和其它蛋白质、血管发生、病毒入侵和肿瘤转移。HS同样保护蛋白质不被降解，调控蛋白质通过基底膜转移，介导蛋白质内置。研究发现细胞表面的HS蛋白聚糖（HSPG）是动态的，它能快速向细胞表面转移并快速返回（t½1-4 h），并通过细胞变化改变HS的结构以应答细胞外信号因子，例如，生长因子。肝素和HS的作用机制涉及它们与蛋白质的非共价结合，以在蛋白质构象中发挥变化，促进蛋白质-蛋白质相互作用，使蛋白质在细胞表面分离并作为生长因子的复合受体发挥作用。因为肝素和HS在调节生物活性方面的作用，在综述一些肝素和HS的功能之前，本文将探讨蛋白质-肝素相互作用的一些重要特点。1 与蛋白的相互作用

HSPG的HS链及肝素与蛋白质的结合主要是静电的，涉及阳离子铵盐基、胍盐以及与肝素或HS的阴离子部位相互作用的多肽或蛋白质的咪唑侧链功能基团。数百种与肝素结合的蛋白质已经被确认，且肝素结合性质经常被应用于它们的分离和纯化，即使用肝素亲和色谱。在很多情况下，涉及到阳离子肝素-结合域与高负电荷肝素之间的非选择性相互作用，这导致通过HS的蛋白质结合是相对非特异性的。但是，研究者逐步认识到经设计的HS的NS和NA/NS域中的特异序列可与特定蛋白质选择性相互作用，这种相互作用可用于调控蛋白质活性。结合的选择性可以通过一种“稀有”成分的使用来得到，例如，在肝素抗凝血酶结合戊糖序列中存在的GlcNS(3，6S)残基，它对于抗凝血活性是必需的。一种独特的结合表位也可以基于N-取代基模式，N-和O-取代基的特异性结合，或是NS（N-硫酸化域）、NA（N-乙酰化域）和NA/NS域的长度和相对位置。其它已知的蛋白质结合序列是由常见的二糖组成。典型地，蛋白质结合涉及3～9个二糖单位，虽然包围在蛋白质低聚体表面的更长的序列也会被涉及。

肝素结合域已经在大量蛋白质中被确认。它们典型地含有相当多的碱性残基赖氨酸和精氨酸，且在某些情况下有组氨酸。除此之外，前文图所示六糖与FGF-2结合形成的复合体的X-线结构显示，某些其它氨基酸侧链的功能基团

也可以与肝素相互作用，例如，谷氨酰胺的酰胺侧链。共有序列组成碱性残基簇，包括序列XBB-BXXBX, XBBXBX和XBBBXXBBBXXBBX，其中B和X分别为碱性氨基酸残基和其他氨基酸残基，上述序列被认为是蛋白质的肝素/HS结合域。这些序列可以采用二级结构，在这种二级结构中碱性氨基酸沿着多肽链的一面对齐，X氨基酸指向蛋白核心。

由于肝素和HS的高负电荷密度，它们都是聚电解质，通过结合反离子中和部分负电荷。所以，结合反应是一个离子交换过程，结合多肽或蛋白质的阳离子部位即为反离子。反离子结合模型显示水溶液中的肝素钠的Na+部分被结合，为每一个负电荷是0.59；已经报道了0.58和0.63的实验值。聚电解质理论提示大部分结合自由能来自多糖Na+反离子熵的有利释放。离子交换机制的一个重要结果是随着NaCl浓度增大结合程度降低。例如，组氨酸的双质子形式与肝素的相互作用结合常数从1.5×106（Na+浓度为0.001 mol/L）降至7.7×102（Na+浓度为0.1 mol/L）。通过相互作用Na+离子被取代的数目已经从结合常数对离子强度的相关性得到，该相关性通过23Na NMR测得。2 肥大细胞中的肝素

肝素和组胺、肥大细胞蛋白酶及其它调控因子一起被储存在肥大细胞的分泌颗粒中。实验已阐明肥大细胞肝素的生理意义。通过敲除大鼠N-脱酰酶/N-磺基转移酶的基因，“正常”即硫酸化肝素的生物合成被阻止。这使得分泌颗粒中其它生物活性调控因子的数目改变，其中最显著的是一些小鼠肥大细胞蛋白酶的水平。可得出一个结论，肝素对于在肥大细胞内特殊颗粒蛋白酶的储存是必要的。

肝素与带有正电荷的肥大细胞蛋白酶之间相互作用的细节尚不清楚，一般认为这种相互作用导致只有正确折叠的蛋白酶才能被定向到分泌颗粒中。

组胺水平在异常肥大细胞中也同样下降，表明肝素对肥大细胞颗粒内组胺的储存发挥了作用。当肥大细胞颗粒的pH值为5.2~6.0时，组胺以双质子形式（H2A2+）存在，这表明组胺在肥大细胞颗粒内通过与高负电荷肝素的静电相互作用储存。腹膜肥大细胞颗粒的体积和组胺含量随着年龄增大。2~7月龄大鼠腹膜肥大细胞中组胺的浓度估计为0.4 mol/L，这足够用于直接在完整肥大细胞分泌颗粒和肥大细胞颗粒中通过1H-NMR研究组胺。通过观察到的肥大细胞颗粒内的组胺的相对尖锐的1H共振峰，研究者确认颗粒内的组胺是流动的。

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通过组胺与有不同精细结构的一系列肝素衍生寡糖的相互作用的1H-NMR研究，以及通过分子模型运算以确定这种结合是位置特异的还是非定域化的，组胺与肝素结合的分子水平上的细节已经被详细表征。组胺的H2A2+形式是有特殊结合位点的，GlcNS(6S)残基的C-3H质子的一个环电流变化可以证明这点。H2A2+的咪唑环对于指导特定位点结合是至关重要的，虽然铵盐基团提高了结合亲和性。咪唑环位于一个裂口内，这个裂口由位于裂口顶端的一个GlcNS（6S）环和形成裂口边的处于1C4构象的两种IdoA(2S)环形成。位于IdoA(2S)-GlcNS(6S)-IdoA(2S)三联体的非还原端上的IdoA的羧基和GlcNS(2S)残基的N-硫酸化基团对结合来说是必要的。同样，糖醛酸残基的构象也很关键，一个类似的三联体与GlcA在还原端的结合缺失也表现了这一点。分子模型结果表明GlcNS(6S)残基的C-3H质子位于咪唑环的屏蔽锥里，同时咪唑环的N-1H和N-3H质子是氢结合在两种IdoA残基的羧基上。由于肝素的延伸折叠结构，在肝素聚合物的交替面存在结合口袋，结果为每一个二糖重复单位结合约一个组胺。

游离的咪唑离子也在IdoA(2S)-GlcNS(6S)-IdoA(2S)三联体形成的结合口袋内进行特定位点结合，这表明肝素对咪唑环的特异性识别。这种特异性识别和结合适用范围扩及多肽甘氨酸-组氨酸-赖氨酸中的组氨酸的咪唑侧链，这对于研究其它多肽和蛋白质与肝素的相互作用也是有重大意义的，其它多肽和蛋白质包括小鼠肥大细胞蛋白酶-7（mMCP-7）和β-淀粉样肽。mMCP-7在肥大细胞分泌颗粒中的储存涉及组氨酸的正电荷侧链在位置8, 68和70与肝素的结合，虽然肝素引发了有pH依赖性的β-淀粉样肽的聚集，这表明在一致的肝素结合域（残基12~17）内位于位置13和14的组氨酸的咪唑侧链也被涉及。肝素与血浆蛋白硒蛋白P的pH依赖结合也涉及组氨酸残基的咪唑侧链。pH依赖是由于咪唑环在pKA≈7时脱质子化，这表现了一种精细和敏感的方式以调控在不同pH值组织和液体中的某些肝素-蛋白质和HS-蛋白质结合相互作用。3 血液凝固的抑制作用

血液凝固涉及一系列连续的失活的前体-丝氨酸蛋白酶转化，这些转化产生凝血酶，凝血酶反过来产生血纤蛋白，血纤蛋白交叉连接形成凝块。血液凝固是由丝氨酸蛋白酶抑制剂抗凝血酶自然调控的。血液中游离的抗凝血酶作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂是相对无活性的。但是，抗凝血酶结合内皮细胞（排列形成脉管系统的内壁）表面HSPG的特定HS链，引发一种构象变化，这种变化促进了抗凝血酶与丝氨酸蛋白酶凝血酶及Xa因子形成紧密的、等摩尔的复合物，这使得血清蛋白酶失活。随着复合物的形成，HS丧失了它对于抗凝血酶的高亲和性，抗凝血酶然后作为丝氨酸蛋白酶-抗凝血酶复合物被释放到血液循环中，同时HS链准备激活其它抗凝血酶分子。据报道，每一个内

4 与脂肪酶的结合及脂蛋白的代谢

内皮细胞表面HSPG的HS链与脂蛋白脂肪酶（LPL）的相互反应及肝细胞表面HSPG与肝细胞脂肪酶（HL）间的相互反应，在清除血浆脂蛋白方面有重要作用。结合使这些酶局限在相关细胞的表面，在其作用于底物的部位脂蛋白释放脂肪酸，然后脂肪酸被细胞吸收。结合同时促进脂蛋白和脂肪酶的细胞胞吞作用和分解代谢。存在于脂蛋皮细胞HS可以提供约5×104个抗凝血酶结合位点。抗凝血酶结合在内皮细胞表面集中内源抗凝血活性在血流内，使得抗凝血活性也存在于脉管系统外的损伤组织。通过与抗凝血酶络合加速凝块中的丝氨酸蛋白酶的失活，肝素临床上被用于抑制血液凝固。但是，肝素在肥大细胞颗粒内是游离的，这与肝素作为天然抗凝剂相反。

前文已述及一种独特的五糖序列调节肝素和内皮细胞表面的HS的抗凝活性。单独的五糖序列会加速由抗凝血酶导致的Xa因子的失活，然而一个更长序列（≥18个糖单位，包括五糖）对于凝血酶的失活是必要的（图 1）。在后一种情况下，结合于同一肝素链邻近区域的抗凝血酶和凝血酶的位置非常接近，形成一个紧密的复合物。五糖序列的结构功能关系已经被详细阐释。GlcN残基在非还原端的N-硫酸化基团和6-O-硫酸化基团，以及内在的GlcN的3-O-硫酸化基团对生物活性是必要的。抗凝血酶的肝素结合区域显现是一个复合部位，涉及来自不同部分的多肽序列，大部分在N端域。包括组氨酸、精氨酸和赖氨酸残基的特异性残基对抗凝血活性来说是必要的，这些特异性残基已经用抗凝血酶变体和NMR光谱学来确定。连接在五糖上的特异性残基和抗凝血酶的构象变化已经从失活的和有活性的抗凝血酶的晶体结构所鉴别。钙能催化肝素介导的抗凝血酶-Xa因子反应，这种催化作用是通过提高中间体肝素-抗凝血酶-Xa因子复合物的集合达到的。

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白微粒中的HSPG和蛋白质的相互反应，也在脂蛋白的代谢上发挥作用，其中最显著的蛋白质是载脂蛋白B和E（apoB和apoE）。

与HSPG结合的LPL可从肝素酶、类肝素酶或内切葡糖苷酸酶处理的培养细胞和内皮细胞的表面释放，所有的酶能降解HS链。这为HS在LPL结合中的作用提供依据。通过与HSPG竞争结合酶，外源肝素也能引起细胞表面结合的LPL释放到血浆。然后，结合肝素的LPL可以结合到血循环中的脂蛋白上催化游离脂肪酸的释放。相较于其它组织来说，脂肪酸主要被肝脏摄取，所以可从血液循环中“清除”。通常存在于血浆中的少量LPL，在血浆中与血循环的脂蛋白形成复合物，通过在肝脏中与肝细胞HSPG的HS链结合从而被清除。肝素与血循环中的LPL结合能防止LPL结合到肝细胞HSPG上，所以减缓了LPL从循环系统中的清除。随着肝素从循环系统中被移除，游离的LPL结合到肝细胞上并被其清除。

据报道，肝素结合LPL的能力比HS强。结合LPL的来源于牛主动脉的内皮细胞HS的最小寡糖即十糖，由五个重复IdoA(6S)-GlcNS(6S)二糖单位组成。这个寡糖序列在HS链中相对少见，然而它在更高硫酸化肝素中的含量更丰富，这与肝素对LPL的高亲和性是一致的。5 生长因子和HSPG

通过与HSPG形成紧密复合物，成纤维细胞生长因子（FGF）、内皮生长因子（EGF）、肝素结合的EGF和肝细胞生长因子（HGF）结合到靶组织的细胞外基质上。HS链精细结构的变化使细胞可控制各个生长因子的应答和改变对生长因子家族不同成员应答的特异性。此简述于碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，又称FGF-2）。

通过结合跨膜FGF受体，FGF-2调控细胞的增殖和分化，FGF受体通过二聚作用激活。HSPG对于生长因子与其受体的高亲和性是必要的。经由HSPG的HS链与FGF-2和受体的特异性相互作用，诱导FGF-2二聚体形成和FGF受体瞬时的二聚作用，通过这种作用HSPG调控FGF-2的活性从而形成信号传导。

HSPGs和肝素与FGF-2相互作用的本质已成为研究热点。FGF-2和肝素衍生四糖∆UA(2S)-GlcNS(6S)-IdoA(2S)-GlcNS(6S)及六糖∆UA(2S)-GlcNS(6S)-IdoA(2S)-GlcNS(6S)-IdoA(2S)-GlcNS(6S)形成的复合物的晶体结构，作为一种蛋白质-肝素寡糖复合物被首先报道。晶体结构显示肝素链在FGF-2结合表面准确录入，这表明相互作用是特异性的并不仅仅涉及电荷的中和。四糖与FGF-2的天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸特异地相互作用，而六糖也可与由赖氨酸、天冬酰胺、赖氨酸形成的另外的结合位点相互作用。IdoA(2S)的2-O-硫酸化基团，GlcNS(2S)的N-硫酸化基团和寡糖的羧基涉及在结合中。在结合过程中，FGF-2结构无显

赵丽娟，樊志萍，边 玲 编译 [Nat Prod Rep, 2002, 19: 312-331.]编者按：本文系“经典论文编译”，供读者参考。本文是本刊2012年9期和11期编译文的续篇，其中有些内容，可参考前文。欢迎对此栏目投稿。

著变化，这表明结合到肝素上形成信号传导通路的并列成分。与FGF-2相互作用需要的可信的糖类模型，已通过组织衍生HS片段的FGF-2亲和色谱被确认。已显示FGF-2结合到带有单一内在IdoA（2S）残基的单-O-硫酸化HS六单体，比结合到在HS八单体内的一个IdoA(2S)-GlcNS-IdoA(2S)三糖上更强。这证明不仅数量还有个别硫酸化基团的位置决定HS对FGF的亲和性。6 细胞的病毒侵入

结合到细胞表面是病毒侵入细胞的关键步骤。通过作为细胞表面受体或协同受体，HSPG的HS链参与了病毒侵入的作用机制，即某些包膜病毒感染其靶细胞，这些病毒包括疱疹病毒，登革热病毒，腺相关病毒和人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）。例如，通过单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的膜糖蛋白gB和gC与细胞表面HS的相互作用，HSV-1结合到细胞上，入侵到细胞内则依赖于第三种病毒糖蛋白gD结合到有特异3-O-硫酸化GlcN残基的HS链上。肝素抑制HSV-1的结合，且用肝素酶或类肝素酶处理细胞，可破坏HSV-1的受体。

HSPG在HIV-1感染细胞中所发挥的作用对HIV治疗学的发展有特别的重要性。在血浆膜-病毒包膜融合过程中，细胞表面HSPG通过与HIV-1包膜糖蛋白gp120的V3环形区域的相互作用，调解CD4+T细胞（HIV-1的主要目标）的有效感染。V3环的序列在不同的HIV-1分离体中是变化的。但是至少五种基本氨基酸的排列被保留下来。肝素抑制HIV-1体外复制，并且这种抑制活性与肝素结合到重组gpl20上的能力有相互关系。Gpl20的V3环是肝素发挥其抗HIV-1活性的部位。HSPG-V3环之间的相互作用在HIV治疗学的发展中是一个潜在靶点，可以用于设计保护细胞不被病毒入侵。7 结语

肝素特别是HS的生物功能是多方面的、各种各样的，并且通过与蛋白质的相互作用来调控。可以预期，我们将很快从HS序列确认中发现其与蛋白质特异性结合的重要过程。一旦特异性蛋白质结合序列被确认，其它方法尤其是NMR和X-线晶体学会被用于表征这种在蛋白质结合过程中涉及的特异性相互作用。这个信息将用于新的治疗靶点的确认，例如，防止细菌和病毒入侵感染细胞。