协同抑制番茄ACO1对果实成熟及病程相关蛋白基因表达的影响

协同抑制番茄ACO1对果实成熟及病程相关

蛋白基因表达的影响

胡宗利，陈国平，吕丽娟，陈绪清， GRIERSON Donald

1

1

1

1

2

（1重庆大学生物工程学院，重庆400030；2 Plant Sciences Division, School of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus,

Loughborough, Leicestershire LE12 5RD, UK）

摘要：【目的】探讨协同抑制番茄ACO1基因对果实成熟和病程相关蛋白基因表达、内源乙烯生物合成及果实耐贮性的影响。【方法】采用PCR或RT-PCR方法克隆了番茄ACC氧化酶1、ACC氧化酶3、EBF1、PR1、PR5以及NP24基因片段，并以此制备探针，以协同抑制ACO1的转基因番茄和野生型番茄为研究对象，进行Northern杂交，同时测定了伤害叶片和果实的乙烯释放量，并进行了果实贮藏试验等。【结果】Northern杂交结果表明，番茄ACO1基因表达被抑制后，与果实成熟相关基因LeACO3和LeEBF1，以及病程相关蛋白基因LePR1、LePR5 和LeNP24的表达量急剧降低。乙烯释放量测定试验和果实贮藏试验结果表明，协同抑制LeACO1番茄完整和受伤叶片以及完整果实内源乙烯释放量相对于野生型番茄大大减少，成熟果实贮藏时间延长。【结论】协同抑制番茄ACO1基因表达的同时，与果实成熟相关基因和病程相关蛋白基因的表达也不同程度地受到抑制，而且其内源乙烯生物合成减少，果实耐贮性增强。

关键词：协同抑制；番茄ACO1；果实成熟；病程相关蛋白基因

The Influence of Co-suppressing Tomato 1-Aminocyclopropane-1 -Carboxylic Acid Oxidase I on the Expression of Fruit Ripening-Related and Pathogenesis-Related Protein Genes

HU Zong-li1, CHEN Guo-ping1, Lü Li-juan1, CHEN Xu-qing1, GRIERSON Donald 2

(1 College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400030; 2Plant Sciences Division, School of Biosciences,

University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, Leicestershire LE12 5RD, UK)

Abstract: 【Objective】The purpose of this study is to explore the influence of co-suppressing tomato ACC oxidase I on the expression of fruit ripening-related and pathogenesis-related protein genes and on the biosynthesis of endogenous ethylene and storage ability of fruits. 【Method】Specific fragments of several fruit ripening-related and pathogenesis-related protein genes from tomato (Lycopersicon esculentum) were cloned, such as the 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase I gene (LeACO1), 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase III gene (LeACO3), EIN3-binding F-box 1 gene (LeEBF1), pathogenesis-related protein 1 gene (LePR1), pathogenesis-related protein 5 gene (LePR5) and pathogenesis-related protein osmotin precursor gene (LeNP24) by PCR or RT-PCR. Then these specific DNA fragments were used as probes to hybridize with the total RNAs extracted from the wild type tomato (AC++) and the LeACO1 co-suppression tomatoes (V1187 and T4B), respectively. At the same time, ethylene production measurement and storage experiment of tomato fruits were carried out.【Result】The hybridization results indicated that the expression of fruit ripening-related genes, such as LeACO3 and LeEBF1, and pathogenesis-related protein genes, such as LePR1, LePR5 and LeNP24, were reduced sharply. The ethylene production in the fruits and wounded leaves decreased.

收稿日期：2006-06-01；接受日期：2006-11-07

基金项目：教育部“留学回国基金”项目（教外司留[2005]55号）；教育部“春晖计划”项目（教外司留[2003]589号）

作者简介：胡宗利（1971-），女，重庆江津人，讲师，博士，研究方向为分子生物学。E-mail：huzongli71@yahoo.com.cn。通讯作者陈国平（1959-），

男，湖北大冶人，教授，研究方向为分子生物学与基因工程。E-mail：chenguoping@cqu.edu.cn

3期 胡宗利等：协同抑制番茄ACO1对果实成熟及病程相关蛋白基因表达的影响 559 The storage time of ripening fruits was prolonged, when the expression of LeACO1 gene in the transgenic tomato was suppressed.【Conclusion】In the co-suppression tomatoes, the expression of fruit ripening-related and pathogenesis-related protein genes were restrained at the different degrees, the biosynthesis of endogenous ethylene decreased and the storage ability of tomato fruits increased.

Key words: Co-suppression; LeACO1; Fruit ripening; Pathogenesis-related rrotein genes

0 引言

【研究意义】乙烯是一种气体植物激素，是调控果实成熟的关键因子，对植物的种子萌芽、生长发育、衰老等均有重要的调控作用。目前，已经明确了高等植物的乙烯合成途径[1,2]，即S-腺苷甲硫氨酸（SAM）在ACC合成酶（ACS）的催化作用下生成1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC），再经ACC氧化酶（ACO）氧化合成乙烯。其中，ACC氧化酶是乙烯生物合成途径中的一个关键酶，最早由Hamilton等[3]发现，后来人们又从许多植物中分离出了ACC氧化酶基因[4~8]【。前人研究进展】 现有研究表明，ACO由多基因家族编码，在番茄中至少包括5个家族成员[9~11]，即LeACO1、 LeACO2、LeACO3、LeACO4、LeACO5等。Barry等 [9]对番茄LeACO1、LeACO2、LeACO3基因在果实成熟、叶片衰老、花发育过程中的表达模式做了较为详细的研究。Nakatsuka等[10]研究了LeACO4在果实发育过程中的表达。这些研究结果表明，番茄ACO基因家族各成员的表达具有明显的组织特异性，其中LeACO1主要在成熟番茄果实中表达。【本研究切入点】本试验以NCBI上发布的番茄LeACO1、 LeACO3、LeEBF1（EIN3-binding F-box 1）、LePR1（pathogenesis-related protein 1）、LePR5（pathogenesis-related protein 5）以及LeNP24基因序列为依据，设计引物，从野生型番茄中通过PCR或RT-PCR扩增出相应的基因片段，并以之制备探针，以协同抑制ACO1的转基因番茄和野生型番茄为研究材料，进行Northern杂交，同时测定了伤害叶片和果实的乙烯释放量，进行了果实贮藏试验等。【拟解决的关键问题】检测并探讨协同抑制番茄ACO1对果实成熟和病程相关蛋白基因表达的影响，以及对内源乙烯合成和耐贮性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

野生型番茄植株（Lycopersicon esculentum Mill. cv Ailsa Craig，AC++）和ACO1协同抑制的转基因番

茄植株V1187、T4B 均来自于英国诺丁汉大学Donald Grierson教授实验室，野生型番茄AC++为转基因番茄V1187、T4B的转基因出发株系，卡那霉素抗性基因-新霉素磷酸转移酶（neomycin phosphotransferaseⅡ，nptⅡ）基因片段为本实验室克隆并保存。 1.2 试剂

Taq酶、PMD18-T载体、限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ（大连宝生物工程有限公司）；DNA凝胶回收试剂盒和DNA标准D2000、Marker III（天为时代科技有限公司）；放射性同位素α-32P-dCTP（北京福瑞生物工程公司），Hybond-N＋ 膜及随机引物标记试剂盒（Amersham Biosciences公司）；寡聚核苷酸引物合成和序列测定委托上海英骏生物技术有限公司。 1.3 方法

1.3.1 果实的收取 按照授粉后的天数计算，约在20～35 d之间的番茄果实均称为幼果， 即Immature Green果实（简称IMG）；授粉35 d之后番茄果实体积大小不再变化且颜色完全呈青色，称为青果时期，即Mature Green果实（简称MG）；随着果实的不断成熟，青果上出现第一抹黄色，称为破色期果实，即Breaker果实（简称B）；破色期过后的第4天基本已呈全红，视为成熟果实（简称B＋4）。

分别收取野生型番茄植株AC++、

转基因番茄植株V1187和T4B的IMG、MG、B、B＋4这4个时期的果实作为样品。

1.3.2 番茄基因组DNA与RNA的提取 提取野生型番茄植株AC++及转基因株系T4B和V1187的幼叶总DNA以及４个不同发育时期的果实，即IMG、MG、B、B+4总RNA，提取方法均按Chen等[12]描述的方法进行。

1.3.3 番茄ACO1、ACO3、EBF1、PR1、PR5以及NP24基因片段的获得 以NCBI公布的番茄ACO1基因序列（GenBank登录号：X58273），ACO3基因序列（GenBank登录号：Z54199）、EBF1基因序列（GenBank登录号：DQ307488）、PR1基因序

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列（GenBank登录号：X71592）、 PR5基因序列（GenBank登录号：AJ277064）和NP24基因序列（GenBank登录号：AF093743）为依据，分别设计特异引物，以AC++幼叶总DNA或B时期果实总RNA为模板，进行PCR或RT-PCR扩增。特异引物序列如下：

LeACO1 Primers ：上游引物：5'-TAA CGG GAA GTA CAA GAG TG-3'；下游引物：5'- CTA CCA TAC ATA AGA AGA GCA A-3'。

LeACO3 Primers：上游引物：5'-AAC AGA TGG GAC TCG GAT GTC ACT A-3'；下游引物：5'-CAC AAC AAT CAC ACA CAC ATA CAC C-3'。

LeEBF1 Primers：上游引物：5'-GGC AAT TAC AGA AGC AAA C-3'；下游引物：5'-CAG GCA CCA CAA CAA CAG-3'。

LePR1 Primer：上游引物： 5'-TAC GCC AAT CAA AGA GC-3'；下游引物：5'-TTC CCA AGT CAC ATA AGC A-3'。

LePR5 Primers：上游引物：5'-TGT GAC TTA CAC TTA TGG TTC CG-3'；下游引物：5'-GTT GTT TCA TTG TGA GTA GAG CC-3'

LeNP24 Primers：上游引物： 5'-GCT CCG AGG GGA ACT AAG A-3'；下游引物：5'-ACC AGG GCA AGT AAA TGT G-3'。

用凝胶回收试剂盒回收、纯化目的片段，将回收产物连接到PMD18-T载体上，然后转化感受态大肠杆菌JM109，并进行α-互补筛选。提取转化子质粒DNA，采用限制性内切酶Hind-Ⅲ和XbaⅠ 进行双酶切验证，挑取阳性转化子菌落进行序列测定。 1.3.4 Southern 杂交分析 以1.9 kb nptⅡ基因片段为模板，按照随机引物标记试剂盒的操作说明，利用同位素α-P32dCTP制备探针，以此探针与经限制性内切酶XbaI完全酶切的10 μg番茄植株AC++、T4B和V1187幼叶总DNA做Southern杂交，其操作过程按《Molecular Cloning》[13]描述进行。

1.3.5 Northern杂交分析 以克隆的LeACO1、LeACO3、LeEBF1、LeNP24、LePR1和LePR5基因片段为模板，用同位素α-P32dCTP制备探针，将这些探针与经甲醛变性胶电泳后的番茄株系AC++、T4B和V1187 4个时期的果实，即IMG、MG、Breaker和Breaker＋4总RNA 20平共处μg杂交，其操作过程按《Molecular Cloning》[13]描述进行。

1.3.6 乙烯释放量的测定 用CP-3800气象色谱仪

（VARIAN）的FID检测器（VARIAN）进行检测。测试条件为： 温度：TJ＝TD＝150℃；Tc＝100℃；载气：氮气；流速：50ml·min-1；分流比：30﹕1；尾吹：30ml-1·min-1。

1.3.6.1 番茄叶片伤害后乙烯释放量的测定 分别取V1187、T4B和野生型番茄植株的成熟叶片，用刀片划成小碎片，密封于下置湿润滤纸的瓶中。每隔24 h，取1 ml气体，进行检测。

1.3.6.2 番茄果实乙烯释放量的测定 取V1187、T4B和野生型番茄B时期的果实，密封于小烧杯中。每隔24 h，抽取1 ml气体，进行检测。

1.3.7 番茄果实的贮藏试验 分别取B+4时期V1187、T4B和野生型番茄果实，置于下置湿润滤纸的盒内，敞口室温放置，比较这3种果实的耐贮性。

2 结果与分析

2.1 番茄ACO1、ACO3、EBF1、PR1、PR5以及NP24

基因片段的克隆

根据GenBank上公布的LeACO1和LeACO3基因序列，比较其同源性，选择差异较大的区域，分别设计特异引物，以AC++总DNA为模板，PCR扩增出相应的基因片段。

拟南芥中研究表明，EBF1是一种F-BOX蛋白，其表达降低了EIN3的积累，EIN3为乙烯信号传导途径中一个重要的转录调控因子，从而EBF1 在乙烯信号传导途径中起着负调控的作用[14]。本课题组首次克隆了番茄EBF1基因，并登录GenBank。本研究中克隆了番茄EBF1基因的一段编码区。

PR蛋白是与病程相关的一系列蛋白，如PR1、PR2、PR3、PR4、PR5等。NP24是番茄中与烟草PR5蛋白同源的一种碱性蛋白质，主要在果实中表达。笔者根据GenBank上已公布的序列，从番茄AC++的B时期果实总RNA中分别克隆出LePR1、LePR5和LeNP24基因片段。

以上所得PCR产物经回收、纯化、克隆、测序，结果表明，这几个基因片段为正确的目标片段。 2.2

Southern blot检测

取野生型番茄AC++以及ACO1协同抑制的转基因番茄植株T4B和V1187的幼叶，分别提取基因组DNA，以同位素标记的nptII基因片段为探针，进行Southern杂交检测，杂交结果如图1所示，AC++基因组中无卡那霉素抗性基因—nptII基因存在，而T4B和V1187中均有2条杂交带出现。由此说明，本试验中

3期 胡宗利等：协同抑制番茄ACO1对果实成熟及病程相关蛋白基因表达的影响 561

所采用的ACO1协同抑制转基因番茄植株T4B和V1187经过继代栽培后没有发生变异，仍然具有ACO1协同抑制转基因番茄的特征。

AC++ T4B V1187

AC++、T4B、V1187番茄基因组DNA经Xba工酶切消化后与放射性标记的nptII基因片段杂交

Genomic DNA of the AC++, T4B and V1187 tomatoes digested with XbaⅠrestriction enzyme was hybridized with the radiolabelled nptII fragment

图1 AC++，T4B，V1187番茄基因组DNA Southern blot检

测

Fig. 1 Southern blot analysis of the genomic DNA from the

AC++, T4B and V1187 tomatoes

2.3 协同抑制LeACO1对果实成熟相关基因表达的影

响

分别以同位素标记的LeACO1、LeACO3和LeEBF1为探针，与AC++和两个协同抑制ACO1番茄株系T4B、V1187的4个果实不同发育时期（IMG、MG、B、B+4）的总RNA进行杂交，Northern杂交结果如图2所示。从图2-a可以看出，LeACO1基因在野生型番茄中的表达随着果实的不断成熟而积累，但在两个协同抑制ACO1转基因番茄T4B和V1187的果实发育过程中，LeACO1基因的表达量基本保持不变，与AC++中的表达比较，强度相对较弱，这说明LeACO1在这两个转基因株系中已被充分抑制。图2-b显示，LeACO3基因在野生型番茄果实B时期表达最强，随着果实成熟度的增加，其表达反而减弱，然而在两个转基因株系T4B和V1187的果实成熟过程中，LeACO3基因完全不表达。图2-c显示，无论是在野生型番茄果实还是协同抑制ACO1的番茄果实中，

LeEBF1基因的表达趋势均相同，即在IMG时期表达最弱，随着果实的成熟，表达量不断增加，B时期表达量达到最高，随后表达开始降低，但是LeEBF1基因在两个转基因番茄株系果实中的表达与野生型番茄果实中的表达相比，大大减弱。根据图2显示的杂交结果，可以推论协同抑制番茄ACO1基因的表达后，与果实成熟相关基因ACO3和EBF1的表达也同时被抑制。

IMG MG B B+4 IMG MG B B+4 IMG MC B B+4

AC++ T4B V1187

a. LeACO1基因在AC++、T4B、V1187果实中的表达；b. LeACO3基因在AC++、T4B、V1187果实中的表达；c. LeEBF1基因在AC++、T4B、V1187果实中的表达

a. Expression of LeACO1 gene in the wild type (AC++), T4B and V1187 tomato fruits; b. Expression of LeACO3 gene in the wild type (AC++), T4B and V1187 tomato fruits; c. Expression of LeEBF1 gene in the wild type (AC++), T4B and V1187 tomato fruits

图2 LeACO1、LeACO3、LeEBF1在野生型番茄和协同抑制

ACO1番茄（T4B、V1187）的不同成熟度果实中的表达 Fig. 2 Expression of LeACO1, LeACO3 and LeEBF1 during

the development of fruits in the wild type tomato and co-suppression LeACO1 tomatoes (T4B and V1187)

2.4 协同抑制LeACO1对病程相关基因表达的影响

从图3可知，LePR1基因在AC++的B时期有非常强的表达，但在AC++果实的其它3个发育时期和T4B果实的4个发育时期，该基因的表达完全被抑制。LeNP24基因在AC++果实的B时期表达最强，IMG时期次之，MG时期最弱，但在T4B果实中却是MG时期最强，B时期次之，IMG时期和B+4时期几乎不表达； LePR5基因在AC++和T4B果实中的表达趋势类似，均为B时期最强，IMG时期的表达强度次之，但不同的是在AC++果实中LePR5表达最弱的为B+4时

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期，在T4B果实中却是MG时期。从图3可以看出，野生型番茄中内源乙烯的大量增加促进了PR蛋白的积累，但在协同抑制ACO1的转基因番茄果实中，PR基因的表达明显减弱，表明抑制内源乙烯的产生对PR基因表达同样有一定抑制作用，其中以PR1最为典型，其表达甚至被完全抑制。由此可见，PR基因表达受到内源乙烯的诱导调控。

IMG MG B B+4 IMG MG B B+4

AC++ T4B a. LePR1基因在AC++

和T4B果实中的表达；b. LeNP24基因在AC++和T4B果实中的表达；c. LePR5基因在AC++和T4B果实中的表达

a. Expression of LePR1 ++gene in AC++ and T4B tomato fruits; b. Expression of LeNP24 gene in AC and T4B tomato fruits; c. Expression of LePR5 gene in AC++ and T4B tomato fruits

图3 LePR1, LeNP24和LePR5基因在野生型番茄及协同抑

制ACO1番茄T4B果实不同发育时期的表达

Fig. 3 Expression of LePR1, LeNP24 and LePR5 during the

development of fruits in the wild type tomato and co- suppression LeACO1 tomato (T4B)

2.5 乙烯释放量的测定结果

2.5.1 番茄叶片伤害后乙烯释放量的测定 野生型番茄完整叶片离体后72 h之内有少量乙烯释放，而两个协同抑制ACO1转基因番茄完整叶片离体后，检测不到乙烯信号，说明这两个转基因番茄植株中乙烯的合成受到充分抑制；然而这3种植株离体叶片经伤害处理后72 h之内，乙烯释放量相应有所增加，其中野生型番茄的增加量最大，是无伤害离体完整叶片乙烯释放量的5～7倍，而两个协同抑制ACO1转基因番茄的乙烯释放量虽然有所增加，但最高也只能达到野生型番茄无伤害离体完整叶片的乙烯释放量（图4）。由此可见，伤害可以强烈刺激野生型番茄叶片中乙烯的合成，但对于乙烯合成途径中ACO1表达受到抑制的番茄叶片，该刺激作用不明显，该实验结果与熊爱生等[15]的研究结果一致。

2.5.2 番茄果实乙烯释放量的测定 AC++番茄B时期完整果实在离体72 h之内有乙烯释放。T4B和V1187同时期果实乙烯释放量极低，密封处理72 h，几乎检测不到乙烯信号，这进一步说明协同抑制番茄ACO1 基因可以有效地抑制乙烯的产生（图5）。

图4 离体完整叶片和离体伤害叶片乙烯释放量测定 Fig. 4 The ethylene production of the intact leaves and

wounded leaves

图5 AC++、T4B和V1187的B时期果实乙烯释放量测定 Fig.5 The ethylene production of the fruits at the breaker

stage from the wild type, T4B and V1187 tomatoes

2.6 AC++、T4B和 V1187番茄果实的耐贮性分析

经观察B＋4时期AC++和T4B、V1187番茄果实贮藏情况发现，AC++果实贮藏9 d后就完全腐烂；T4B 果实贮藏9 d后除了有部分失水的现象，基本看不到腐烂的迹象；V1187果实贮藏17 d后仅有部分失水现

3期 胡宗利等：协同抑制番茄ACO1对果实成熟及病程相关蛋白基因表达的影响 563

象；贮藏60 d后，部分转基因番茄开始出现腐烂且失水严重。由此可见，在相同的贮藏条件下，协同抑制LeACO1的番茄果实耐贮性比野生型番茄果实的耐贮性强，延长其B＋4果实货架期50 d左右。

3 讨论

本研究表明，LeACO1基因在野生型番茄成熟果实中大量表达，LeACO3基因在野生型番茄果实B时期表达最强，随着果实成熟度的增加，其表达反而减弱，并且其表达强度远远低于LeACO1的表达强度，该结果与Barry等 [9]的研究结果一致。但是在协同抑制ACO1番茄株系的果实发育过程中，LeACO1的表达急剧下降，LeACO3也几乎不表达（图2-a，b）。 LeACO1基因是番茄果实成熟过程中的主要调节因子，LeACO1基因被抑制的同时，也同样阻断了与果实成熟有一定相关性的LeACO3的表达。

EBF是最早从拟南芥中分离出来能与EIN3相互作用的F框蛋白，共有两大类，即EBF1和EBF2[16]。Guo等 [14] 和Gagne 等[17]研究表明拟南芥EIN3蛋白是一个乙烯调控有关基因表达和形态反应过程中的关键转录因子，乙烯可以快速地提高拟南芥EIN3蛋白水平，在没有乙烯存在的情况下，EIN3蛋白可以快速地通过EBF1 和 EBF2 所介导的ubiquitin/proteasome途径而降解。这表明ubiquitin/ proteasome 途径通过降解EIN3蛋白而淬灭乙烯信号，从而表现出对乙烯信号的负调节。番茄同源基因EBF1是否具有与拟南芥EBF1相似的功能？对番茄果实成熟相关基因表达是否具有调控作用？目前还未见相关的报道。本研究表明，无论是在AC++果实，还是在T4B和V1187果实中, EBF1基因在B时期都有表达，不过在协同抑制LeACO1番茄果实中的表达强度与野生型番茄相比，大大减弱（图2-c）。由此可以推测，协同抑制LeACO1，番茄果实中乙烯的生物合成受阻，内源乙烯减少（图5），可能导致番茄EIN3蛋白水平降低，那么在其体内对降解LeEIN3蛋白的需求减少，从而LeEBF1的表达水平降低。但LeEBF1的功能和对乙烯信号转导的调控机理还有待进一步研究。

PRs（pathogenesis-related proteins）是一类病程相关蛋白，它是一类只有在病理或病理相关的环境下才被诱导表达的蛋白，最早从烟草花叶病毒（TMV）侵染的烟草叶片中发现[18]，至今已从30多种植物中分离出各种PRs[19]，在众多PRs中以烟草PRs研究得最清楚，相比之下，人们对番茄的PRs研究得较少。目

前从番茄中分离了PR1 [20]、

PR5、NP24 [ 21]、PR-P23 [22]、PR-P69 [23]、PR-P2 [24]等PR蛋白基因，本研究中选择了番茄PR1、PR5、NP24基因来研究协同抑制LeACO1对病程的影响。研究结果表明，协同抑制LeACO1表达的同时，也使PR基因的表达明显减弱，其原因可以从两个方面理解。一方面，已有研究表明许多病程相关基因（PR基因）的启动子具有GCC框，乙烯信号转导途径中的下游信号转导组分—乙烯反应因子ERFs (ethylene-response factors) 可以特异性的结合于该GCC框上，从而启动PR基因的表达 [25,26]。在协同抑制LeACO1转基因植株T4B中，因乙烯生物合成受到抑制，乙烯信号转导途径中可以与GCC框结合的ERFs的表达降低，进而导致PR基因的表达降低。另一方面， LeACO1受到抑制后，T4B和V1187果实的耐贮性增强，使其不易受病原菌的侵染，而病原菌的侵染是PR基因表达的诱导因素，在诱因缺乏的情况下，PR基因的表达较低。

基因沉默（gene silencing）是转基因植物中特定基因由于种种原因不表达或表达量很低的遗传现象。根据基因沉默发生的时期，基因沉默分为转录水平的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）和转录后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS） 。前者通常与DNA甲基化有关，表现为mRNA 不能正常合成，造成基因失活。后者虽能合成mRNA，但随后被降解而不能积累，并同时诱导与外源基因同源的内源性基因沉默。近年来，随着转录后基因沉默机制的深入探讨，使人们能够利用它有目的地使特定基因降低表达或不表达，PTGS 技术在功能基因组学和植物改良中显示出巨大的应用潜力。在植物的功能基因组研究及作物改良中，常用的PTGS或RNAi技术，按介导方法包括正义RNA介导的协同抑制、反义RNA介导的基因抑制、病毒介导的基因沉默（VIGS）和hpRNA（hairpin RNA）介导的基因沉默。协同抑制现象（co-suppression）首先由Napoli 等[27]在研究转基因矮牵牛时发现的，当时他们将这种现象称为协同抑制，也叫正义抑制（sense suppression，相对于导入反义RNA的反义抑制）。

Waterhouse等[28] 首次明确了dsRNA 在植物基因沉默中的关键作用，他们后来又以靶基因反向重复序列构建成一种发卡结构，将带此结构的hpRNA载体导入植物体后，在转录过程中产生mRNA 发卡结构，发卡茎部形成稳定的dsRNA，诱导同源的内源基因沉默[29]。关于LeACO1基因的沉默已有一些报道，

564 中 国 农 业 科 学 40卷

叶志彪等[30]及熊爱生等[15]采用反义基因技术转化番茄，获得果实乙烯释放量降低、贮藏期延长的转基因番茄植株；Xiong A S等[31]后来又采用构建hpRNA载体转录后形成dsRNA和直接转入siRNA的方法抑制LeACO1基因的表达，获得不同抑制程度的番茄植株，而且其贮藏期延长到120 d。Han等[32]以LeACO1正义基因抑制，反义基因抑制和hpRNA介导抑制的转基因番茄为材料，比较了这3种转基因番茄的抑制效率，探讨了RNAi的抑制机理，研究表明由hpRNA介导的基因沉默方法比单独采用正义或反义基因片段转化能更有效地抑制基因表达。本研究表明，协同抑制LeACO1转基因番茄株系T4B和V1187中，外源和内源LeACO1基因的表达受到了强烈的抑制，进而强烈地抑制了乙烯的生物合成，乙烯释放量极低，密封处理72 h，几乎检测不到乙烯信号。因为番茄贮藏过程中，释放到空气中的乙烯达到一定浓度时，将进一步促进果实成熟，导致果实很快腐烂，转基因番茄株系T4B和V1187乙烯释放量极低，将有利于果实耐贮性的提高。

ACC氧化酶基因是一个多基因家族，本文着重探讨了协同抑制LeACO1对果实成熟相关基因和病程相关基因表达的影响，以及对内源乙烯合成和果实耐贮性的影响，而对于这一多基因家族中其他成员进行基因沉默，其影响如何，有待进一步的研究。

4 结论

协同抑制番茄ACO1基因表达的同时，与果实成熟相关基因和病程相关蛋白基因的表达也不同程度地受到抑制，而且其内源乙烯生物合成减少，成熟果实耐贮性增强。

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（责任编辑 曲来娥）