绵羊血液基因组DNA的提取方法研究

２００８年４月　第２期３７～４０　甘肃农业大学学报　Ｊ（）ＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＧＡＮＳＵ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　第４　３卷　双月刊　绵羊血液基因组ＤＮＡ的提取方法研究　包鹏甲，胡　江，罗玉柱，成述儒　（甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州　７３００７０）　摘要：用ＦＴＡ采样卡采集２４份绵羊血样，用优化ＮａＯＨ—ＴＥ法提取血液基因组ＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增后．与　Ｗｈａｔｍａｎ　ＦＴＡ　ｒｅａｇｅｎｔ　ＤＮＡ提取法进行比较，结果认为ＮａＯＨ—ＴＥ　ＤＮＡ提取法在进行聚合酶链式反应时具有高　效、快速、便捷、经济的特点．　关键词：血液；基因组ＤＮＡ；线粒体ＤＮＡ；聚合酶链式反应　中图分类号：Ｓ　８２６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００３—４３１５（２００８）０２—００３７—０４　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｈｅｅｐ　ｂｌｏｏｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ＢＡＯ　Ｐｅｎｇ—ｊｉａ，ＨＵ　Ｊｉａｎｇ，ＬＵＯ　Ｙｕ—ｚｈｕ，ＣＨＥＮＧ　Ｓｈｕ—ｒｕ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｗｅｔｙ　ｆｏｕｒ　ｓｈｅｅｐ　ｂｌｏｏｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｅｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＦＴＡ　ｃａｒｄｓ　ａｎｄ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＮａＯＨ—ＴＥ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｂｌｏｏｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ：ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｗｈａｔｍａｎ　ＦＴＡ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＮａＯＨ—ＴＥ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｑｕｉｃｋ，ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｃｏｎｏｍｉｃａ１．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｂｌｏｏｄ；ｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ；ｍｔＤＮＡ；ＰＣＲ；ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　随着基因分子生物学研究的不断深入，有效便　亡、衰老、疾病诊断、人类疾病及家畜经济性状　（ＱＴＬ）等的研究　引．本文采用ＮａＯＨ—ＴＥ两步　法嘲（简称ＮａＯＨ法），以提取绵羊基因组进行线粒　捷的ＤＮＡ提取方法日渐重要．血液标本含有丰富　的ＤＮＡ信息，是分子生物学重要检测内容，而简便　有效的ＤＮＡ提取方法是ＰＣＲ扩增成功的基本要　求．目前，哺乳动物血液基因组ＤＮＡ提取方法很　体ＤＮＡ　Ｄ－Ｌｏｏｐ全序列ＰＣＲ扩增为例，旨在建立　一种哺乳动物血液基因组ＤＮＡ提取优化方法．　多，但是都存在不同程度的缺点．线粒体ＤＮＡ（ｍｉ－　ｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ＤＮＡ，ｍｔＤＮＡ）是动物体内存在的唯一　核外遗传物质，其分子为共价、闭合、环状结构．　ｍｔＤＮＡ以其分子量小、进化速度快（为单拷贝核基　因的５～１０倍）、遗传上具有自主性及严格的母系遗　传等特性，被广泛地用于分子进化、生物分类、群体　１　材料与方法　１．１　材料　采集２４份藏绵羊颈静脉血液，每只２　ｍＬ，不加　任何抗凝剂滴在ＦＴＡ采样卡（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｍｉｄ～　ｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）上，陈旧血样（非肝素抗凝剂抗凝，采集　后一８Ｏ℃保存３～５　ａ）也按照新鲜血样的方法滴在　遗传结构分析、亲缘关系鉴定、法医学鉴定、细胞凋　作者简介：包鹏甲（１９８０一），男，在读硕士研究生，甘肃武威人，研究　方向为生物技术与动物育种．　ＦＴＡ采样卡上，在干净的环境中避光晾干后室温保　存，ＤＮＡ提取所用试剂为２０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ，ＴＥ　缓冲液（１０　ｍｍｏｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ，０．１　ｍｍｏｌ　ＥＤＴＡ，ｐＨ　通讯作者：罗玉柱（１９６２一），男，教授，博士生导师，甘肃景泰人，Ｅ—　ｍａｉｌ：ｌｕｏｙｚ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　８．Ｏ），将这２种试剂高压灭菌后４℃保存备用．　ＦＴＡ反应液（Ｗｈａｔｍａｎ　ＦＴＡ　ｒｅａｇｅｎｔ）由Ｗｈａｔｍａｎ　资助基金：国家“８６３”计划课题（２００６ＡＡ１０Ｚ１９６）、甘肃省科技攻关　项目（２ＧＳ０４２－Ａ４１－００１－１０）和甘肃省农业生物技术项目　（ＧＮＳＷ－２００４—０５）．　公司生产，ｐｕｎｃｈ取样器，ＰＣＲ扩增所需引物根据　Ｈａ　Ｊ　Ｍ和Ｃｈｕｎｇ　Ｈ　Ｙ在Ｇｅｎｅｂａｎｋ上提交的绵羊　线粒体全序列（登录号：ＡＹ８５８３７９）设计，上游引物　收稿日期：２００７—０４－１０　维普资讯 http://www.cqvip.com

３８　甘　肃　农　业　大　学　学　报　Ｌ一１５３９３为：５’一ＣＣＡＣＴＡＴＣＡＡＣＡＣＣＣＡＡＡＧ－３’，　下游引物Ｈ一２８为：５’。ＴＣＡＴＣＴＡＧＧＣＡＴＴＴＴＣＡ—　置２　ｍｉｎ后，尽量弃尽液体部分，室温下风干圆盘备　用．４）用Ｗｈａｔｍａｎ　ＦＴＡ　ｒｅａｇｅｎｔ提取基因组ＤＮＡ　ＧＴＧ一３’，委托上海生物工程公司合成，期望扩增长　度约１　３００　ｂｐ，扩增使用的Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５　／　Ｌ）为美国ＭＢＩ公司生产，其它ＰＣＲ反应所用　则严格按照生产商提供的使用说明进行．　１．２．２　ＰＣＲ扩增及结果检测　用以上２种方法提　取的ＤＮＡ直接进行ＰＣＲ扩增（每个圆盘约含有　试剂均由上海生工生物工程技术服务有限公司　生产．　１．２　方法　ＤＮＡ　５Ｏ～１００　ｎｇ），采用３Ｏ　Ｌ体系进行，各种试剂　使用量如表１所示，反应步骤为９４℃预变性５　ｍｉｎ，　９４℃４５　Ｓ，５４℃４５　Ｓ，７２。Ｃ　９０　Ｓ，３５个循环，７２℃　１．２．１　ＤＮＡ的提取　１）用取样器（ｐｕｎｃｈ）在　延伸１０　ｍｉｎ，４℃保存．扩增结束后采用１．０　的琼　脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ扩增结果（表１）．　ＦＴＡ采样卡上取若干直径为１．２　ｍｍ的圆盘，每个　０．２　ｍＬ的ＰＣＲ管中放入１个圆盘备用　．２）在　上述放入圆盘的离心管中加入２００肚Ｌ　２０　ｍｍｏｌ／Ｌ　的ＮａＯＨ，在室温下分别孵育１０、１５、２Ｏ、２５　ｍｉｎ，陈　２　结果　２．１不同洗涤时间对ＰＣＲ反应的影响　旧的血样则在５Ｏ℃下分别孵育１５、２０、２５、３０　ｍｉｎ，　在孵育过程中可以翻转离心管，孵育结束后，弃去液　体部分．３）在管中加入２００肚Ｌ的ＴＥ　缓冲液，静　不同的ＦＴＡ圆盘洗涤时间对ＰＣＲ反应有明显　影响，对新鲜血样，洗涤最佳时间为２０　ｍｉｎ，，而对　陈旧血样最佳洗涤时间为２５　ｍｉｎ（图１、图２）．　表１　ＰＣＲ扩增使用试剂及用量　Ｔａｂ．１　Ｒｅａｇｅｎｔ　ａｎｄ　ｄｏｓａｇｅ　ｏｆ　ＰＣＲ　２　３　４　９　注：每３个泳道为１组，洗涤时间分别为１０、１５、２ｏ、２５　ｒａｉｎ，Ｍ．ｍａｒｋｅｒ；由上至下分别为１　５００、１　０００、８００、６００、４００、２００　ｂｐ　图１　洗涤时间对新鲜血样ＤＮＡ　ＰｅＲ反应的影响　Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｗａｓｈ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｆｒｅｓｈ　ｂｌｏｏｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ＤＮＡ　ｆｏｒ　ＰＣＲ　１　２　３　４　５　６　Ｍ　７　８　９　１０　１ｌ　ｌ２　注：每３个泳道为１组，洗涤时问分别为１５、２０、２５、３０　ｒａｉｎ，第７泳道为ｍａｒｋｅｒ，由上至下分别为１　５００、１　０００、８００、６００、４００、２００　ｂｐ　图２　不同洗涤时间对陈旧血样ＤＮＡ进行ＰＣＲ反应的影响　Ｔａｂ．２　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｗａｓｈ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｏｌｄ　ｂｌｏｏｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ＤＮＡ　ｆｏｒ　ＰＣＲ　维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期　包鹏甲等：绵羊血液基因组ＤＮＡ的提取方法研究　２．２不同ＤＮＡ提取方法对ＰＣＲ反应的影响　Ｗｈａｔｍａｎ　ＦＴＡ　ｒｅａｇｅｎｔ法均可以扩增出目的片断　（图３、图４）．　用ＮａＯＨ—ＴＥ法洗涤新鲜血样２０　ｍｉｎ进行　ＰＣＲ反应，经过电泳检测，采用ＮａＯＨ—ＴＥ法和　ｌ　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　ｌｌ　ｌ２　１３　ｌ４　ｌ５　１６　ｌ７　Ｍ　ｌ８　ｌ９　２０　２ｌ　２２　２３　２４　注：Ｍ．ｍａｒｋｅｒ，由上至下分别为１　５００、１　０００、８００、６００、４００、２００　ｂｐ．　图３　ＮａＯＨ法洗涤新鲜血样２０　ｍｉｎ进行ＰＣＲ检测结果　Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｕｓｅｉｎｇ　ＮａＯＨ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓｈ　ｆｒｅｓｈ　ｂｌｏｏｄ　ｓａｍｐｌｅ　ｆｏｒ　２０　ｍｉｎｕｔｅｓ　ｌ　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１　ｌ２　ｌ３　ｌ４　ｌ５　ｌ６　ｌ７　Ｍ　ｌ８　ｌ９　２０　２ｌ　２２　２３　２４　注：Ｍ．ｍａｒｋｅｒ，由上至下分别为１　５００、１　０００、８００、６００、４００、２００　ｂｐ．　图４　Ｗｈａｔｍａｎ　ＦＴＡ　ｒｅａｇｅｎｔ法进行ＰＣＲ检测结果　Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｕｓｉｎｇ　Ｗｈａｔｍａｎ　ＦＴＡ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　片段长度最大，电泳时移动的距离最短．但纯度最　３　讨论　低，酚一氯仿法、酚抽提法、异丙醇沉淀法提取的　提取血样基因组ＤＮＡ的方法在现代分子生物　学研究中已经比较常见，这方面的报道也比较多．王　文，史立明１９９３年报道了一种改进的碱变性法提取　ＤＮＡ片段长度相差不大，电泳带大于２３　ｋｂ，可以　满足以噬菌体为载体ＤＮＡ构建基因组文库的要　求．但酚抽提法、异丙醇沉淀法提取的ＤＮＡ纯度较　线粒体ＤＮＡ的方法，经过电泳检测发现，改进的　ｍｔＤＮＡ提取方法简便快速，适用范围广，对设备和　试剂的要求都不高，而得率和纯度都可满足ｍｔＤ—　ＮＡ片段长度多态性分析的要求　］．资晓林，陈漪在　１９９５年用从血凝块抽提ＤＮＡ的方法提取ＤＮＡ，进　行常规ＤＮＡ分折，指出该方法提取的人染色体　ＤＮＡ适合于一般常规的ＤＮＡ分析［７］．韩喜荣，胡　永华　用盐析法从全血、血凝块、ＷＢＣ中提取基因　组ＤＮＡ进行电泳检测发现，全血ＤＮＡ产量最高，　血凝块产量其次，ＷＢＣ产量最低；用盐析法从３种　血液标本类型提取的ＤＮＡ，以全血ＤＮＡ产量和质　量最佳．　万发春，王慧等　。　通过蛋白酶Ｋ和ＳＤＳ消化破　低．电泳时拖尾现象严重，不能满足ＰＣＲ的要求．　酚一氯仿法和血细胞ＤＮＡ快速提取法获得的ＤＮＡ　纯度很高，电泳时无拖尾现象，电泳带清晰，可以满　足ＰＣＲ试验的要求．酚一氯仿法可以同时满足以噬　菌体为载体ＤＮＡ构建基因组文库和ＰＣＲ试验的　要求　．张宁，王凤山Ｄ０３通过对从陆生动物、植物、　微生物以及海洋生物来源的ＤＮＡ的传统提取方法　及近年来诸多的改良方法分析指出，酚抽提法、异丙　醇沉淀法以及甲酰胺裂解法获得的ＤＮＡ纯度很　高，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，　且所用试剂具有一定的毒性．玻璃棒缠绕法对操作　技术要求较高，且简单快速．　血细胞ＤＮＡ的快速提取法从血液中分离获得　碎细胞，用酚一氯仿去除蛋白质，用异丙醇沉淀解离　出ＤＮＡ进行检测，发现甲酰胺解聚法获得的ＤＮＡ　的ＤＮＡ纯度高，能够满足各种临床检验和实验的　需要．玻璃颗粒吸附法获得了理想的纯化ＤＮＡ．盐　维普资讯 http://www.cqvip.com ４０　甘　肃　农　业　大　学　学　报　析法用饱和氯化钠代替有机溶剂去除蛋白质，所获　得的ＤＮＡ质量可以满足ＰＣＲ模板的要求，但产率　相对较低，纯度较差．谭建明等对上述盐析法进行了　改进，即将处理过的样本加入ＳＤＳ和蛋白酶Ｋ后，　在５６℃消化１　ｈ，然后用饱和氯化钠沉淀蛋白质，并　经离心除去，上清直接用乙醇沉淀ＤＮＡ．所获ＤＮＡ　的纯度可以满足各种检测的需要．曾文涛，徐鸿绪等　采用ＮＰ一４０及辛酸法提取血液有核细胞ＤＮＡ，通　过对２００份血标本及部分淋巴细胞标本ＤＮＡ的提　取，与煮沸法及标准酚一氯仿法同步进行了对比研　究，结果显示ＮＰ一４０法及辛酸法操作简单、快捷，耗　时分别为６０　ｍｉｎ及２０　ｈ，且结果稳定、可靠，所获　ＤＮＡ的量及纯度与标准酚一氯仿抽提法无差异，用　于ＨＬＡ—ＤＲ、ＤＱ基因分型均获成功Ｈ”．林经安，黄　建文ＬＩ　对３种常用的提取血液ＤＮＡ方法所提取的　ＤＮＡ进行ＨＬＡ—Ｂ。　的检测结果比较得出：３种提取　血波ＤＮＡ方法所提取的ＤＮＡ的含量和纯度基本　一致，简化盐析法最省时、简单　引．　采用优化的ＮａＯＨ—ＴＥ法，在血样采集过程中　可以避免添加抗凝剂、反复离心、低温保存等步骤，　可以大大减轻采集血样时携带大量设备，且采集后　血样体积小，易存储，只需保存在干净．干燥环境中　即可，无须低温冷冻．在基因组ＤＮＡ提取时仅用两　步，且每步所用时间均不超过３０　ｍｉｎ（第１步１５～　２５　ｍｉｎ，第２步２　ｒａｉｎ），提取的ＦＴＡ圆盘只需放置　于灭菌ＰＣＲ管内，常温或者４¨Ｃ保存即可，进行　ＰＣＲ反应时只需在管内加入反应液即可进行扩增．　经测试本方法不仅可以进行常规ＰＣＲ反应，还可以　用于测序、微卫星分析，ＳＳＣＰ检测以及ＳＮＰ等，可　以在诸多分析中使用，且效果明显，是进行血样的采　集、保存、ＰＣＲ扩增的好方法．　参考文献　［１］　Ｗａｎｇ　Ｃｕｎｆａｎｇ。Ｚｅｎｇ　Ｙｏｎｇｑｉｎｇ，Ｄｕ　ｌｉｘｉｎ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅ—　ｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ＤＮＡ［Ｊ］．Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎ。２００１，１８（１）：１６－１８　［２］　Ｓａｉｒａ　Ｓ，Ｈｉｄｅｙｕｋｉ　Ｍ．ＰｏＩｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ＤＮＡ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｉｏｎ　ｉｎｆｅｒｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐａｋｉｓｔａｎｉ　ｇｏａｔｓ［Ｊ］．Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉ—　ｅｎｃｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２００４，７５：３０３—３０９　［３３　Ｚｈｏｕ　Ｈ，Ｈｉｃｋｆｏｒｄ　Ｊ　Ｇ　Ｈ，Ｆａｎｇ　Ｑ．Ａ　ｔｗｏ－ｓｔｅｐ　ｐｒｏｅｅ—　ｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｄｒｉｅｄ　ｂｌｏｏｄ　ｓｐｏｔｓ　ｏｎ　ｆｉｌｔｅｒ　ｐａｐｅｒ　ｆｏｒ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｍ—　ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。２００６，（３）：１－３　［４３　罗玉柱，成述儒，Ｂａｔｓｕｕｒｉ　Ｌｋｈａｇｖａ．等．用ｍｔＤＮＡ　Ｄ－　环序列探讨蒙古和中国绵羊的起源及遗传多样性［Ｊ］．　遗传学报，２００５，３２（１２）：１２５６—１２６５　［５］成述儒，韩建林，Ｏｌｉｖｉｅｒ　ｈａｎｏｔｔｅ。等．中国绵羊群体　ｍｔＤＮＡ的遗传多样性分析［Ｊ］．甘肃农业大学学报，　２００５，４０（４）：４４０—４４７　［６］王文，史立明．一种改进的动物线粒体ＤＮＡ提取方　法［Ｊ］．动物学研究，１９９３，１４（２）：１９７—１９８　［７］资晓林，陈漪．血凝块中染色体ＤＮＡ提取方法［Ｊ］．　中国公共卫生学报，１９９５，１４（５）：ｌ７９—１８０　［８］韩喜荣，胡永华．血液标本类型及保存方式对ＤＮＡ产　量、质量的影响［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２００２，１２（５）：　５４Ｏ一５４２　［９］万发春，王　慧，吴乃克．血液中ＤＮＡ提取方法的研　究［Ｊ］．山东畜牧兽医，１９９９，（１）：６－７　［１Ｏ］　张　宁，王风山．ＤＮＡ提取方法进展［Ｊ］．中国海洋药　物，２００４，９８（２）：４０—４６　［１１］　曾文涛．徐鸿绪，王晓波．几种血液ＤＮＡ快速抽提法　的比较及临床应用［Ｊ］．广州医药，１９９９，３０（１）：５８—６０　［１２３林经安．黄建文．三种提取血液ＤＮＡ方法的比较［Ｊ］．　中华医学写作杂志，２００２，９（６）：４８８—４９０