利用PCR技术鉴别畜禽肉中禽源性成分研究

利用PCR技术鉴别畜禽肉中禽源性成分研究

作者：张晶鑫 樊艳凤 唐修君 贾晓旭 高玉时 顾荣 陆俊贤 王珏 来源：《湖北农业科学》2016年第15期

摘要：为了建立一种快速、特异的禽源性成分检测方法，以线粒体16S rRNA基因序列为靶位点设计鸡、鸽、鹌鹑特异性引物，以常见畜禽肉（包括羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等）DNA为模板，进行PCR扩增和特异性检测。结果表明，筛选的引物能够有效地对动物源性成分进行检测，方便简洁，可快速鉴别畜禽肉食品中含有的鸡源性、鸽源性、鹌鹑源性成分。

关键词：禽源性成分；16S rRNA基因；PCR；鉴别

中图分类号：TS251.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）15-4021-03 DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.056

Abstract： In order to establish a quick and specific peculiar method， which could identify the components of poultry origin. 16S rRNA gene sequence was use as target site， the specific primers of chicken， pigeon meat and quail meat were designed. The DNA of common livestock and poultry meat including mutton， beef， pork， rabbit meat， pigeon meat， quail meat， chicken， duck and goose were used as template. Though PCR amplification and specific detection， a quick determination method was established to identify the components of poultry origin. The results showed that the selected primer could identify the components of animal origin effectively and quickly. The method was convenient and concise， and could detect the chicken origin， pigeon origin and quail origin in poultry food quickly and accurately.

Key words： components of poultry origin；16S rRNA gene；PCR；identification

肉与肉制品掺杂、掺假是目前食品质量控制面临的重要挑战。一些不法商家或个人为了追求自身利益以低价劣质的肉冒充高价优质的肉，严重侵犯了消费者的合法权益，更直接影响着消费者的健康。因此，对食品中原料肉进行掺假、掺杂检验显得尤为重要，其重点就是快速、准确地鉴定肉品成分来源[1]。

PCR技术具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点，在肉类掺假检测方面具有巨大的应用价值，已成为肉制品品种鉴别最常用的方法之一[2]。目前，PCR技术由于其独特的优势在国内外肉类掺假的研究中已得到广泛应用，并取得创新性成果[3-5]。

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在目标基因选择方面，动物线粒体基因组DNA序列具有高度的物种特异性，是设计肉类成分定性检测的首选靶点，包括细胞色素b（Cyt b）基因、12S rRNA、16S rRNA、D-Loop基因等[6-8]。本研究选择16S rRNA基因序列为靶基因，通过基因序列比对，设计筛选出鸡、鸽和鹌鹑的特异性引物，以羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉9种肉的DNA为模板，建立运用PCR技术鉴别鸡肉、鸽肉和鹌鹑肉的快速检测方法。 1 材料与方法 1.1 试验材料

以市售合格的鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、兔、鸽以及鹌鹑肉为材料，每种动物样品充分搅碎混匀，-20 ℃保存备用。 1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 采用离心柱式组织基因组DNA小量抽提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取总DNA。提取的总DNA样品溶于100 μL洗脱液TE中，于-20 ℃保存备用。 1.2.2 引物设计与合成 根据16S rDNA序列用Primer Premier 5.0软件设计筛选出各物种的特异性引物对，由上海生工生物工程有限公司合成。取适量引物用高压灭菌后的超纯水溶解，配制成10 μmol/L储备液。引物序列、Tm值与扩增片段大小详见表1。

1.2.3 PCR扩增和检测 PCR扩增体系（25 μL）：2×Tag Master Mix（南京博尔迪公司）12.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，模板1 μL，灭菌水10.5 μL。反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60～62 ℃30 s，72 ℃ 60 s，28个循环；72 ℃ 4 min。反应完成后将PCR产物取出，利用1.5%低溶点琼脂糖（Promega公司）凝胶电泳检测PCR产物。

1.2.4 PCR产物测序 PCR产物电泳后割胶回收纯化，交由上海英骏生物技术有限公司进行测序，所有序列采用双向测序，以便比对核实，测序结果与GenBank上已知序列进行比对。 2 结果与分析

2.1 不同动物PCR检测结果

分别对每种动物设计3对引物，经过反应条件优化，并用同一种引物对所选择的9种动物进行PCR扩增，最终每种动物筛选出一对特异性引物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，具体见图1。将PCR产物回收、纯化、测序，将测序结果与GenBank上的已知序列进行比对，比对结果显示，鸡的测序结果与已发表序列（GenBank登录号分别为AB086102.1、GU261713.1、GU261678.1）、鸽子的测序结果与已发表序列（GenBank登录号分别为X87858.1、KP258178.1）、鹌鹑的测序结果与已发表序列（GenBank登录号分别为AF302070.1、

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AB073301.1）的同源性均在99%以上，与预期结果基本一致，确定分别为鸡肉、鸽肉和鹌鹑肉成分。

2.2 引物特异性分析

以羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉9种肉的DNA为模板，分别对所设计筛选的有关鸡肉、鸽肉、鹌鹑肉的引物进行特异性分析，具体见图2。图2中阳性对照分别为鸡肉、鸽肉和鹌鹑肉。

由图2可见，利用鸡的引物，只有鸡肉的DNA模板能扩增出444 bp的目的条带；利用鸽子的引物，只有鸽肉模板能扩增出600 bp的目的条带；利用鹌鹑的引物，只有鹌鹑肉的DNA模板能扩增出767 bp的目的条带。 3 讨论

近年来，动物源性食品掺假、过分添加各种添加剂、使用非食用性原料和成分等食品安全事件频发。一项对近千种肉制品的检测分析表明，有近20%的产品存在标识与品种不完全相符的现象[2]。因此，建立快速、准确的检测方法，研究动物源性食品安全检测技术，对食品进行动物源性成分鉴定，有利于维护消费者利益，保障人民生命安全，也有利于肉类产业健康发展。

以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术已逐步成为肉类种属鉴定的核心方法。研究者根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源。Girish等[6]基于线粒体12S rRNA基因，应用PCR-RFLP成功鉴定了牛肉、水牛肉、绵羊肉及山羊肉。Ghovvati等[4]基于线粒体12S rRNA和16S rRNA基因应用多重PCR技术对反刍动物、家禽和猪进行鉴别。Soares等[9]应用双重PCR在猪肉中成功检测到禽肉。陈文炳等[10]应用单重PCR和双重PCR分别对食品中猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉等肉类成分进行鉴定。陈冬等[11]利用牦牛、普通牛、水牛作为研究材料，在牛线粒体12S rRNA基因通用引物扩增片段区域发现3个特异的酶切位点，可用于混合鲜牛肉及制品的牛种来源的鉴别。何玮玲等[12]基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点，设计两组各5条长度不同的多重PCR引物，建立并优化多重PCR反应体系，通过电泳检测扩增产物分子量差异，实现4种肉类（猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉）的快速鉴别。王颖等[13]以猪线粒体12S rRNA基因序列为靶位点设计引物和探针，进行荧光定量PCR扩增，建立了猪源性成分检测方法。

本研究主要根据鸡、鸽、鹌鹑线粒体基因组编码基因16S rRNA序列的位点差异设计各物种特异性引物，进行PCR扩增检测，经过多次反复试验，建立了快速、准确的鸡肉、鸽肉、鹌鹑肉PCR鉴定方法，该方法样品用量少，反应体系简单，对设备要求不高，成本低廉，在下一步工作中，将开展16S rRNA序列荧光定量PCR技术，进一步研发食品中不同动物源性成

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分分析方法，为肉制品质量安全控制探索新的途径，为保护消费者权益提供技术支撑，并为保护肉类产业健康发展提供技术监督。 参考文献：

[1] 何玮玲，黄 明，张 驰.食品中肉类成分种属鉴别技术研究进展[J].食品科学，2012，33（3）：304-307.

[2] BALLIN N Z，VOGENSEN F K，KARLSSON A H. Species determination-can we detect and quantify meat adulteration？[J]. Meat Science，2009， 83（2）：165-174.

[3] YIN R H， BAI W L， WANG J M， et al. Development of an assay for rapid identification of meat from yak and cattle using polymerase chain reaction technique[J]. Meat Science，2009， 83（1）：38-44.

[4] GHOVVATI S，NASSIRI M R，MIRHOSEINI S Z，et al. Fraud identification in industrial meat products by multiplex PCR assay[J].Food Control，2009，20（8）：696-699. [5] 陈 冬，柏 凡，周明亮，等.基于线粒体12S rRNA基因鉴别混合牛肉及制品的牛种来源[J].遗传，2008，30（8）：1008-1014.

[6] GIRISH P S，ANJANEYULU A S R，VISWAS K N，et al. Meat species identification by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP） of mitochondrial 12S rRNA gene[J]. Meat Science，2005，70（1）：107-112.

[7] MURUGAIAH C， NOOR Z M， MASTAKIM M， et al. Meat species identification and Halal authentication analysis using mitochondrial DNA[J]. Meat Science，2009，83（1）：57-61. [8] MANE B G， MENDIRATTA S K， TIWARI A K. Polymerase chain reaction assay for identification of chicken in meat and meat products[J]. Food Chemistry，2009，116（3）：806-810. [9] SOARES S，AMARAL J S，MAFRA I，et al. Quantitative detection of poultry meat adulteration with pork by a duplex PCR assay[J].Meat Science，2010，85（3）：531-536. [10] 陈文炳，邵碧英，廖宪彪，等.加工食品中若干动物成分的PCR检测技术应用研究[J].食品科学，2005，26（8）：338-342.

[11] 陈 冬，柏 凡，周明亮，等.基于线粒体12S rRNA基因鉴别混合牛肉及制品的牛种来源[J].遗传，2008，30（8）：1008-1014.

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[12] 何玮玲，张 驰，杨 静，等.食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法[J].中国农业科学，2012，45（9）：1873-1880.

[13] 王 颖，史艳宇，刘金华，等.荧光定量PCR方法检测畜肉食品中猪源性成分[J].食品安全质量检测学报，2013，4（5）：1529-1534.

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