原生质体新方法

叶片（宽：2cm,长：5cm在最适光照条件下；宽：0.5cm,长：2.5cm在弱光照条件下），选取生长在最适光照(ca. 150 μE·m-2·s-1) 或弱光照(ca.50·μE m-2·s-1)条件下的3-5周大的拟南芥。叶子上表皮粘附于Time tape (Time Med, Burr Ridge, IL)固定，下表皮粘附于Magic tape (3 M, St. Paul, MN)固定，将MT小心的与TT分离，将下表皮细胞层剥落。剥皮的叶子（7-10片最佳光照条件下的叶子，大约1-2g，最多5g）仍粘附着TT泡进乘有10mL酶解液（1%纤维素酶，0.25%离析酶，0.4M 甘露醇，10mM CaCl2,20mMKCl,0.1%BSA和20mM MES,pH 5.7）的Petri dish ，光照条件下轻轻摇动（平面震荡器40rpm）20-60min直到原生质体与液体混合。离心100G 3min，用25mL W5（154mM NaCl,125mM CaCl2,5mM KCl,5mM 葡萄糖，2mM MES，pH 5.7）溶液冲洗两次，在冰上培养30min。在培养期间，用血细胞计数器在光学显微镜下。离心并用MMg（0.4M甘露醇，15mM MgCl2,4mM MES pH 5.7）至终浓度为2-5×105个/mL

浓度大约为5×104个/mL（2×104个/mL到1×105个/mL）的原生质体0.2mL与30μg(20μg-40μg)的质粒DNA，加入等体积的PEG（40%[w/v]PEG,01M CaCl2,0.2M 甘露醇）混匀，在室温下培养5min。缓慢加入3mL的W5，混合，离心100G 1min，重复两次，再用1mL W5重悬，轻涂在带有1%BSA的平板上室温培养16小时或过夜培养 【GFP用505-530nm】

【烟草】BY-2烟草原生质体分离后用MMG(0.4 M 甘露醇, 15 mM MgCl2, and 4 mM MES, pH5.7)重悬至1×105 /mL。100μL原生质体与质粒（10-20μg）轻轻混合，再滴加等体积PEG(40% PEG [丙烯酰胺], 0.4M甘露醇, 和 0.1 M CaCl2)，混合后在室温下培养5min，随后加入2mL W5，轻轻混合，190g 离心3min，弃上清，原生质用2mLW5清洗一次，再次离心弃上清，用0.6mL培养液(BY-2 medium[per l,4.33 g Murashige and Skoog salts, 370 mg KH2PO4, 1.0 mg 维生素B1,

2.0 mg 2,4-D, and 30 g Suc, pH 5.7] 加 0.4 M 甘露醇)，the protoplasts distributed into wells of a BSA-coated plastic 24-well plate。原生质体室温下过夜培养