嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳定细胞株的步骤及方法

Puromycin 是来源于 Streptomyces alboniger 的一种氨基核苷类抗生素，中文名为嘌呤霉素，常用于筛选能够表达 pac 基因（puror）的细胞。pac 基因表达嘌呤霉素 N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，如果该基因表达，就会对嘌呤霉素产生抗性，这一特性目前普遍应用于筛选表达 pac 基因的哺乳动物稳定细胞株。目前，很多商业化的慢病毒载体都携带 pac 基因(一般在质粒图谱上标记为 puror)，可以利用嘌呤霉素的筛选，得到特定基因稳定表达的细胞株。嘌呤霉素也可以用来筛选表达 pac 基因的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。

Puromycin 不仅能用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。Puromycin 的作用特点是快速作用于细胞，一般 2 天内可以杀死 99%的不表达 pac 基因的细胞。本产品浓度为 10mg/ml，已过滤除菌，可以直接用于细胞培养。 使用说明：

一 、 推荐工作浓度：

推荐的作用于哺乳动物细胞的嘌呤霉素浓度一般为 1-10μg/ml，但最佳工作浓度需要通过剂量反应曲线来确定。

二 、 嘌呤霉素剂量反应曲线的确定( 以 shRNA ） 转染或者慢病毒感染为例）： ：

嘌呤霉素的有效筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢及细胞所处细胞周期等因素相关。为了筛选到稳定表达的 shRNA

或感染病毒的细胞株，确定杀死未转染/感染细胞的最低浓度嘌呤霉素非常重要。对于初次使用的细胞，一般需要通过实验来确定适合自身实验体系的剂量反应曲线(dose-response curve or kill curve)。 1、第一天：24 孔板中以 5~8×10 4 cells/孔的密度接种细胞，接种够量的孔以便进行后续的剂量梯度实验。细胞培养箱内培养过夜。 2、第二天： 在培养过夜后的细胞中更换新鲜配制的筛选培养基，该筛选培养基为含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如 0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml 等)，更换培养基后在细胞培养箱中继续培养。 3、第三天后：由于嘌呤霉素可以快速作用于细胞，一般 2 天内可以杀死 99%的未表达pac 基因的细胞，所以在加嘌呤霉素后的 1-2 天就可以进行观察细胞存活率，从而确定有效杀死正常细胞的药物最低浓度。如果细胞耐药性比较强，需要每日观察，一般 4-10天内即可确定嘌呤霉素的最低浓度。

三 、 哺乳动物稳定表达细胞株的筛选：

转染含有 pac 基因的质粒或者感染含有该基因的病毒后，即可筛选稳定表达株。

1、细胞转染或感染 48 小时后，将细胞置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养，此为处理组。

注意：当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用最明显。细胞过于密集，抗生素产生的效力会明显下降，所以细胞的过密度最好不超过 25% 。建议同时做一个正常细胞的对照组。转染或感染 48 小时后，如果细胞过密也可以消化后重新接种细胞，培养过夜后即可进行嘌呤霉素筛

选。

2、每隔 2-3 天，更换含有嘌呤霉素的培养基。

3、筛选 7 天后，对照组正常细胞应该 100%死亡，处理组中存活的细胞为表达 pac基因的细胞。然后根据实验目的进行多克隆或单克隆细胞的筛选。要注意：每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要 24 小时，有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在 2-10 天。

4、待细胞可以稳定生长后，嘌呤霉素的浓度可以减半用于后续的培养。在得到稳定表达细胞株后，一般建议嘌呤霉素也须持续加入，并 2-3 天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液。