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鸡艾美耳球虫阶段性抗原的分子生物学研究进展

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安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2006,34(16):3991—3992 责任编辑刘月娟责任校对范世群 鸡艾美耳球虫阶段性抗原的分子生物学研究进展 王承民 ,秦建华2 7何宏轩3 7郑素玲1,李任峰1(1.河南科技学院动物科学学院,河南新乡453o03;2河北农业大学动物科技学 院,河北保定071001;3.中国科学院动物研究所国家野生动物疫病研究中心,北京100080) 摘要从裂殖子表面抗原、细胞器抗原、子孢子抗原3个方面,综述了鸡艾美耳球虫阶段性抗原的分子生物学研究。 关键词艾美耳球虫病;抗原;分子生物学 中图分类号¥852.72+3 文献标识码A 文章编号0517—6611(2006)16—3991—02 目前由于耐药性、药物残留等问题,加之人们对肉蛋奶 盲肠免疫接种后却能刺激鸡体产生部分保护性免疫[61。 等产品的质量要求更加严格,研究工作者们不得不转向疫 苗的研制。分子生物学技术应用于球虫免疫原性研究,不仅 对抗原的种类、结构、免疫原性以及在诱导机体产生抗球虫 保护性免疫的机制方面进行了分析,而且为球虫亚单位疫 苗的研制提供了手段。 1裂殖子表面抗原 Jenkins和Dame等用E.acen,ulina第3代裂殖子表面 抗原的多克隆抗体从cDNA文库中筛选出10个片段,该片 段表达的融合蛋白分子量为150kDa,其中虫体蛋白为35kDa, 该蛋白为裂殖子250 kDa免疫显性抗原的一部分,并具有 部分保护性…。Binger用兔抗E.tenella裂殖子表面抗原的抗 体从cDNA文库中筛选出一个片段,并在大肠杆菌中表达 出分子量为33 kDa的重组蛋白[21。Ko用抗裂殖子抗原的单 克隆抗体LPMC一61从E.tene11a子孢子cDNA文库中筛选 出一个片段,并在大肠杆菌中表达出分子量为142 kDa的 融合蛋白,其中虫体蛋白为31 kDa。该虫体抗原与子孢子、 裂殖子和未孢子化的卵囊的10~12 kDa(有还原剂条件下) 和80 kDa(无还原剂条件下)相对应。Castle报道用该抗体 克隆出了一种cDNA片段,编码虫体10 kDa蛋白(MA16), 体外试验证实该融合蛋白(MA16)能引起T细胞免疫反应_3l。 Ffied用抗大配子体82 kDa的多克隆抗体(F一33)从大配子 体表达cDNA文库中筛选出一种cDNA片段(pem230),在原 核生物中表达出73 kDa的蛋白,该蛋白对应于大配子体的 230 kDa的蛋白,但其免疫原性和保护性未见报道141。Jenkins、 Dame鉴定的E.acen,ulina的45种主要抗原(分子量20~250 kDa)中,绝大多数均位于裂殖子表面[11。Martin鉴定E. a en, lina引起细胞介导以及体液免疫反应的抗原,电泳分 离裂殖子和子孢子成分.Ma n还发现分子量在12.7~18.4 kD 的裂殖子成分干扰素产生多,攻毒后产生良好的抗体 反应;分子量在18.4~29 kDa的裂殖子成分可引起很高的抗 体滴度和少量淋巴细胞增殖;分子量在29~43 kDa的裂殖 子成分能引起大量淋巴细胞增殖,但抗体反应平常,干扰素 产生少;分子量在60~127 kDa的裂殖子成分在抗体反应、 干扰素产生的量及淋巴细胞增殖方面均不明显嘲。谢明权等 认为第2代裂殖子抗原在免疫方面无应用价值;应用第2 代裂殖子蛋白加福氏完全佐剂,大剂量且多次免疫接种后 未能表现出保护性免疫应答,而有活力的第2代裂殖子经 基金项目 河南科技学院重点资助项目(0313)。 作者简介王承民(1978一),男,河北承德人,硕士,讲师,从事动 物寄生虫病和分子生物学研究工作。 收稿日期2006—03—10 Wallach等报道,宿主自然感染或人工感染球虫的配子体均 可诱发良好的免疫保护,高滴度的康复鸡血清或纯化配子 体免疫的血清主要识别分子量分别为56、82和230 kDa的 配子体抗原 】。Wallach报道56 kDa的配子体抗原能够对 E.maxima的攻击感染提供部分被动保护_8l,而Fried等认为 它对编码大配子体的230 kDa基因所表达的重组蛋白的抗 体似乎能与成囊体特异性的结合 。研究表明,230 kD 裂 殖子抗原和配子体蛋白能够提供55%~80%的保护[91。 2细胞器抗原 子孢子和早期第1代裂殖子中折光体是嗜锇酸的,电 子致密的均质细胞器可能与虫体贮存能量有关,但其功能 不详。入侵阶段虫体的棒状体和微线为一电子致密的嗜锇 酸结构,可能与虫体的入侵有关,但其功能不详。Da forth和 Augustine用单克隆抗体研究了子孢子内部抗原,较为有意 义的抗原主要位于折光体内,分子量为21~28 kDallO]。研究 表明,当E.tenella发育时折光体扩散到整个裂殖体,与折光 体作用的单抗能阻止其扩散而抑制裂殖体发育,说明折光 体在艾美耳球虫的无性发育阶段发挥重要作用。Jenkins用 抗E.acervulina裂殖子顶复合器30~47 kDa的单抗筛选出 一种cDNA片段(Eamzp 30~47)。编码虫体的棒状体和虫体 表面30~47 kDa cDNA的一部分…j。蛋白质印迹试验表明, Eamzp 30~47 kDa蛋白由裂殖体的4-3或4.0、3.8 kh的RNA 表达,在子孢子中不表达。免疫试验表明,该EamzD 30~47 kDa蛋白能引起T细胞免疫应答。Laurent用单克隆抗体克 隆出一种cDNA片段,该片段在大肠杆菌中表达出分子量为 80 kDa的融合蛋白FA6S2,抗FA6S2抗体只与E-acen,ulina、 E.tenella、E.maxima和E.falaciformis中惟一一种43 kDa蛋 白反应;该抗原定位于折光体上,蛋白几乎不引起体液免 疫,原因是FA6S2蛋白不与感染球虫鸡的抗体反应,也不与 虫体自然抗体反应【l2l1=verrneulen先后用抗E-acervulina子孢 子的单抗和兔抗子孢子的多抗从cDNA kgtl 1文库中筛选 出一个片段,并在大肠杆菌中表达出分子量为160 kDa的 融合蛋白(EalALacz),其中虫体蛋白为45 kDa,用鸡抗该融 合蛋白的抗体证实为折光体膜上一种分子量为100 kDa的 蛋白【l3】。Jenkins用针对折光体膜上22 kDa抗原的单抗筛选 出一种cDNA片段,并在大肠杆菌中表达出分子量为125 kDa的融合蛋白(MAI—LacZ),其中虫体蛋白约为10 kDa,该 蛋白不引起体液免疫反应,能引起特异性细胞免疫反应 1。 Miller用抗E.tenella子孢子28 kDa的单抗Mab12—09从 cDNA文库中筛选出一个片段,并在大肠杆菌中表达出分子 量为115 kDa的融合蛋白。根据DNA序列,推测出虫体蛋 维普资讯 http://www.cqvip.com

3992 安徽农业科学 2006生 白分子量为12 kDa,表明它能使免疫鸡产生部分保护性,该 重组抗原在体外能刺激致敏T淋巴细胞的转化l151。Tomley用 Eth16片段从cDNA文库中筛选出一个eDNA片段,编码74 kDa的蛋白,此蛋白与E.tenella的微线蛋白(Etp100)关系密 [2】BINGER M H.Cloning and characterization of a surface antigen of E tenella merozoites an(1 expression using a recombinant vaeeiniavirus[J]. Molecular and Biochem Parasitology.1 993.6 1:1 79—1 88. f31 CASTLE M D.Characterizati0n of a recombinant E ace ̄ulina 切。Pasamontes用针对微线蛋白Etp100的单克隆抗体筛选 E.maxima卵囊的),eDNA文库技术及基于EtlO0基因序列 的PCR技术,从E.maxima克隆出微线蛋白Emp100基因 1161。antigene pressed in sporozoite and merozoite dPvel。pmentalstage J]. J Parasitology 1991.77(3):384—390. [41 FRIED M.Developmental gene expression of a 230 Kdamac-rogamete— speciifc protein of the avian coccidial parasite E nlaxinla IJ】. Molecular and Bioehem Parasitology.1992.51:251—262. 参与细胞粘附及细胞一细胞接触有关的Emp100、 【5】MARTIN A,AWADAI LA S,ULLEHOJ H S.Characterization of eel1. mediatedresponses to Eimeria aeervulina antigens[J].Avian Disease. 1995.39:538—547. Eml00和Etl00基因都存在于E.tene11a和E.maxima的微 线蛋白中,表明鸡球虫的微线很可能参与虫体与宿主的细 [6]谢明权,吴会贤.柔嫩 美耳球虫裂殖予免疫原性的研究IJl_畜牧兽 胞膜接触的过程。 3子孢子表面抗原 Jenkins和Dame等鉴定了堆型和柔嫩艾美耳球虫子孢 子的一组 I标记的表面抗原、 S一氨基酸标记和未标记的 细胞浆和内膜成分,发现有32~45个主要抗原成分,分子量 为9~350 kDd”。Danforth等报道有19种抗原能与免疫血清 发生沉淀反应l10l。Danforth等还用单克隆抗体技术鉴定子孢 子表面抗原,发现大多数能阻止子孢子侵入宿主细胞的单 抗与子孢子表面抗原起作用,并具有种特异性 。一些研究 者用免疫血清筛选出25种与半乳糖苷酶融合的表面蛋白, 如csz一1和5401抗原,具有免疫潜能。csz一1抗原是E. acervulina子孢子表面蛋白的一个约为10~15 kDa的片段, 该抗原能引发机体T细胞反应,但不具有保护性免疫作用; 5401抗原是E.tenella的一个31 kDa的表面抗原片段,它对 E.tenella经口感染产生部分保护ll0l,用该抗原免疫的鸡血清 对可溶性子孢子抗原进行免疫印记分析,与66和200 kDa 的抗原带反应。Brothers利用TA4基因片段克隆出了 eDNA,eDNA序列说明内含子在mRNA成熟时被剪切掉, 合成的多肽在跨膜时切去3个多余的Arg—Arg—Lei1,再以二 硫键连接8和17 kDa的多肽形成完整的TA4抗原 】。子孢 子表面抗原TA4分子量为25 kDa,是在孢子化16~24 h合 成的。Kramer用与子孢子200 kDa蛋白反应的单抗7B2克 隆出了一种1.1 kb长的eDNA片段,并在大肠杆菌中表达 出分子量为45 kDa的融合蛋白,单抗1207与E.acer、rulina 的子孢子8~120 kDa的蛋白反应『l9】。Ko用抗裂殖子抗原的 单克隆抗体LPMC一61从E.tene11a子孢子cDNA文库中筛 选出一个片段,并在大肠杆菌中表达出分子量为142 kDa 的融合蛋白,其中虫体蛋白为31 kDa[2o]。该虫体抗原与子孢 子和未孢子化的卵囊的10~12 kDa(有还原剂条件下)和80 kDa(无还原剂条件下)相对应。 4小结 保护性抗原可能由各个阶段具有部分保护性的虫体抗 原共同组成。目前,重组抗原只能诱导产生部分保护性。研 究球虫防治的主要任务是克隆出各阶段虫体中具有部分保 护性的抗原,并且将各阶段的保护性基因制成核酸疫苗Im], 同时采用适当的提呈抗原系统如病毒载体表达系统ll6 以更 好防治鸡球虫病。 参考文献 [1]JENKINS M C,DAME J B.Idetification of immunodominant surface antigen of Eimeria aeervulina sporozoites andmeroziotes….Mol Biochem Parasitol,1987,25(2):155—164. 医学报,1994.25(4):340—345. 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