第２９卷第４期 广西师范大学学报：自然科学版 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏ１．２９ Ｎｏ．４ Ｄｅｃ．２０１１ ２０１１年１２月 盐酸胍诱导牛血红蛋白变性的微量热研究 李向荣 ，于洁 ，郝潇潇。 （１．新乡医学院基础医学院，河南新乡４５３００３；２．河南师范大学化学与环境科学学院，河南新乡４５３００７） 摘要：应用恒温微量热技术，对盐酸胍与牛血红蛋白在３Ｏ。ｃ水溶液中的结合作用及造成牛血红蛋白变性 的过程进行研究，并根据简单结合模型，计算了它们之间的结合常数、结合自由能。用变性中点的直线外推方 法求出了表观变性焓。实验结果表明，盐酸胍诱导牛血红蛋白变性的相互作用分为３个阶段。牛血红蛋白在 盐酸胍溶液中的变性焓在ｐＨ５．２１时为２００ ｋＪ・ｍｏｌ～，在ｐＨ６．７０时为５４０ ｋＪ・ｔｏｏｌ～，在ｐＨ８．０３时为１２０ ｋＪ・ｔｏｏｌ～。牛血红蛋白在ｐＨ６．７０时，即在等电点时，较稳定。 关键词：牛血红蛋白；恒温微量热；盐酸胍；变性 中图分类号：０６４２．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：ｉ００１—６６００（２０１１）０４—００８８—０４ 蛋白质变性是指蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性 质的改变和生物活性的丧失。对蛋白质变性的研究可以提供许多有关其结构、性质和功能的信息口］，因此， 蛋白质变性的研究受到了生物化学、生物物理学和结构生物学领域研究工作者的关注［。． 。微量热法通过 测定过程的热量变化研究蛋白质和变性剂间的相互作用，该方法对反应体系的溶剂性质、光谱性质和电学 性质等没有任何限制条件，在测定中不需要添加任何试剂，因而在蛋白质变性研究中越来越受重视 。 血红蛋白是红细胞的主要成分，是… 种由４个亚基组成以血红素为辅基的结合蛋白，其亚基结构为 ａ。 ，０ｔ链由１４１个氨基酸组成，ｐ链由１４６个氨基酸组成。血红蛋白是动物及人体内执行输氧任务的蛋白 质，它具有别构效应，高亲氧态（Ｒ态）与低亲氧态（Ｔ态）间的构象转变有利于其载氧功能的发挥［７］。许多 临床疾病（如：白血病、贫血病、心脏病等）均与血红蛋白有密切的关系［８］。牛血红蛋白（ＢＨｂ）同源于人血红 蛋白，其中９０ 的氨基酸序列与人血红蛋白相同Ｌ９］。作为能可逆的输送和储存氧气的重要功能蛋白，牛血 红蛋白结合其他分子后其结构和功能的变化，已经成为目前研究的焦点Ｌｌ ”］。我们采用微量热技术，对盐 酸胍造成牛血红蛋白变性的过程及机理开展研究。 １ 实验部分 １．１试剂与仪器 牛血红蛋白（ＢＨｂ）购于美国Ｓｉｇｍａ公司，相对分子质量为６４ ５００；盐酸胍（ＣＨ Ｎ。・ＨＣ１）购于中国医 药集团上海化学试剂公司，分析纯；其他试剂均为分析纯，使用前未进一步纯化。配置溶液所使用的水均为 二次蒸馏水。 微量热计（ｃ一８Ｏ型，法国ＳＥＴＡＲＡＭ公司）；精密酸度计（ＰＨＳ一２Ｃ型，上海大普仪器有限公司）； ＪＡ５００３型电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）。 １＿．２实验方法 分别用邻苯二甲酸氢钾（Ｃ Ｈ ＫＯ ）一氢氧化钠（ＮａｏＨ）、磷酸二氢钠（ＮａＨ。ＰＯ ・２Ｈ。Ｏ）一磷酸氢二钠 （ＮａＨＰＯ ・１２Ｈ。Ｏ）、硼酸（Ｈ。ＢＯ。）一氢氧化钠（ＮａＯＨ）３种缓冲溶液作为溶剂配制盐酸胍溶液，其浓度为 ０．５～６．０ ｍｏｌ・Ｌ＿。。以０．１ ｍｏｌ・Ｌ 的ＨＣ１或ＮａＯＨ溶液将盐酸胍溶液ｐＨ值调为５．２１、６．７０和８．０３ 三种系列。利用相同的缓冲溶液作为溶剂配制１．１０×１０ ｍｏｌ・Ｌ 的牛血红蛋白储备液，放入冰箱１～４ 收稿日期：２０１１－０６—１６ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（２０６７３０３４） 通讯联系人：李向荣（１９７９一），女，河南长垣人，新乡医学院讲师。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｘｉａｎｇｒｏｎｇ７９＠ｓｏｈｕ．ｃｏｎ：， 第４期 李向荣等：盐酸胍诱导牛血红蛋白变性的微量热研究 。Ｃ保存。 分别取０．５ ｍＬ牛血红蛋白溶液（牛血红蛋白的最终浓度为１×１０ ｔｏｏｌ・Ｌ ）和５ ｍＬ盐酸胍溶液， 置于微量热计（最低热功率测量指标为１ ｗ）反转混合池的２个池内。将装好样品的反转池置于３Ｏ。Ｃ的 微量热计内，待热平衡后测定它们的混合焓。此混合焓除了牛血红蛋白与盐酸胍的结合焓，还包括牛血红 蛋白溶液的稀释焓和盐酸胍溶液的稀释焓。用相同的方式和溶液用量，测定盐酸胍溶液与作为溶剂的缓冲 溶液的稀释焓，将其从混合焓中扣除，而牛血红蛋白与缓冲溶液的稀释焓经测定是很小的，可以忽略。由此 得到牛血红蛋白与盐酸胍的结合焓。在进行实验测定之前，利用量热计所配的ＥＪ。焦耳效应池对量热计进 行校正，所测热效应的偏差为±０．５％Ｌ１ 。 ２结果与讨论 实验所得的每摩尔牛血红蛋白与盐酸胍的结合焓如表１所示。 表１牛血红蛋白与盐酸胍的结合焓 Ｔａｂ．１ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｔｈａｌｐｙ ＡＨｍ ｂｅｔｗｅｅｎ ＢＨｂ ａｎｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ △ ／（ｋＪ・ｍｏｌ ）（ｐＨ５．２１）一１２９—１８０—２２０—３７９—４４０—４８７—５３５—５８８—６３０—８８５一ｌ １３５—１ ３１３ △Ⅳｍ／（ｋＪ・ｍｏｌ ）（ｐＨ６．７０）一１３７—２３７—３４２—４９１—６３７—６７８—７６３—７９１—８３８—９６２一ｌ １４６—１ ４１０ △Ⅳｍ／（ｋＪ・ｍｏｌ ）（ｐＨ８．０３）一１１１—１６３—１９０—２３８—３０８—３４０—３６０—４００—４８０—７２９—９２５—１ １５９ 从理论上分析，当盐酸胍溶液较稀而未造成蛋白质结构变化时，此焓效应就是盐酸胍与蛋白质的结合 焓，而当盐酸胍浓度较大造成蛋白质结构变化时，则此焓效应中还包括蛋白质结构变化的热效应。由于蛋 白质本身结构的复杂性，导致它与变性剂间结合作用的复杂性。为了简化起见，对此结合作用我们采用简 单结合模型，即认为蛋白质的每个结合位点只能结合一个盐酸胍分子，它们对盐酸胍的结合是相互独立 的，结合的强度也是一样的。令蛋白质的结合位点为Ｐ，盐酸胍分子为Ｇ，则结合反应为： Ｐ＋Ｇ－－ＰＧ， 此结合反应的平衡常数为： Ｋ 一鑫， （１） （２） 式中ＣＰＧ和Ｃ 为单位体积内蛋白质已结合和未结合盐酸胍分子的结合位点的数目，相当于浓度的概念， ｃｏ为盐酸胍分子的浓度。令△ 为每摩尔蛋白质与盐酸胍产生的结合焓，△ 为每摩尔结合位点与盐酸 胍的结合焓， 为蛋白质分子具有的对盐酸胍分子的结合位点数，则它们之间的关系为： △ ｒｍ— △ ×Ｋ 干 Ｃｃ 。 （３） 此式可转化为： Ａ Ｈ－一ｍ一 ＡＨＡＫＡ——ＫＡ△ —。 （４） ＬＧ 因此，可将实验得到的ｎＨｍ／Ｃｃ对△ 作图，从所得线性关系得Ｋ 和ｎＡＨＡ。这里Ｃ。是盐酸胍的实际浓 度，如果用初始浓度来代替则会出现一些误差，但考虑到所配制的盐酸胍浓度比牛血红蛋白的浓度大得 多，同时利用简单结合模型本身也有误差，作为粗略的计算，我们以盐酸胍的初始浓度近似代替其实际浓 度。根据热力学关系，蛋白质的结合位点与盐酸胍的摩尔结合自由能为： ｎＧｍ．Ａ一一Ｒ７１ｌｎＫＡ。 （５） 我们把盐酸胍浓度较小时的结合焓按照式（４）作图，从所得直线的斜率和截距得到牛血红蛋白的结合 位点与盐酸胍结合的Ｋ 和ｎＡＨＡ，再由式（５）得二者的摩尔结合自由能△Ｇ ｌＡ，这些数据如表２所示。 虽然表２中的数据是依据简单结合模型得 表２牛血红蛋白和盐酸胍结合的，ｌ△日 、Ｋ 和△ ． 出的，与实际情况可能有差别，但我们仍能据此 Ｔａｂ．２ Ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｎＡＨＡ，ＫＡ ａｎｄ△Ｇ口ｍ．Ａ ｆｏｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ＢＨｂ ａｎｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ 得出一些有意义的结论。由表２数据可知， ｐＨ８．０３时的平衡常数Ｋ 最大，结合过程的热 效应ｎＡＨＡ以及标准吉布斯自由能变△Ｇｏｍ． 则 最小，说明牛血红蛋白和盐酸胍在弱碱性条件 下更易于结合。不同ｐＨ下的ｎＡＨＡ数值不同， ９Ｏ 广西师范大学学报：自然科学版 第２９卷 说明牛血红蛋白的结合位点与盐酸胍分子的结合焓受溶液ｐＨ值的影响。而３种ｐＨ下的△Ｇ口ｍ均为正值 ． 仅说明在标准条件下，结合不能自发进行。我们的实验是在盐酸胍浓度很大，而蛋白质浓度很小的条件下 进行的，此时的结合是自发的。 把表１中牛血红蛋白与盐酸胍结合的结合焓对其浓度 作图，得到图１。 从图１可以看出在３种ｐＨ下，牛血红蛋白与盐酸胍结 合产生的焓效应随盐酸胍浓度的变化关系呈现３个阶段，这 和牛血清蛋白与尿素及盐酸胍的量热实验结果是一致 的Ｌ１ ］。盐酸胍浓度在２．５ ｔｏｏｌ・Ｌ 以下为第一阶段，此阶 段牛血红蛋白的结构还未发生变化，是以自然态存在。盐酸 胍浓度在２．５～４．５ ｔｏｏｌ・Ｌ 为第二阶段，此阶段牛血红蛋 白结构受到盐酸胍分子的强烈作用发生松动并逐渐打开，而 图１ 牛血红蛋白和盐酸胍的结合焓随盐酸胍浓 度的变化关系 Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ Ａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＢＨｂ ａｎｄ 此阶段热效应的变化比较平缓是由于蛋白质结构打开的吸 热效应与盐酸胍分子结合的放热效应有所抵消所致。盐酸胍 浓度在４．５ ｍｏｌ・Ｌ 以上为第三阶段，此阶段牛血红蛋白 ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ 的结构已完全打开，是以变性态存在。把从第一和第三阶段 数据向中间线性外推到变性中点时的热效应之差认为是蛋 白质的变性焓［１ ，根据变性中点的直线外推所得牛血红蛋白在盐酸胍溶液中的变性焓在ｐＨ５．２１时为 ２００ ｋＪ・ｔｏｏｌ＿。，在ｐＨ６．７０时为５４０ ｋＪ・ｔｏｏｌ＿。，在ｐＨ８．０３时为１２０ ｋＪ・ｔｏｏｌ＿。，说明牛血红蛋白在 ｐＨ６．７０时，即在等电点时，较稳定。图１中ｐＨ６．７０的曲线位置在上，说明此时盐酸胍与牛血红蛋白作用位 点结合所放的热量最多；ｐＨ８．０３的曲线在下，说明在弱碱性的条件下，盐酸胍与牛血红蛋白结合放热最 少，这与表２中ｎＡＨａ的数值是一致的。从图１还可以看到，变性后的直线斜率比变性前的大，说明牛血红 蛋白变性后，结构打开，有更多的结合位点与盐酸胍分子结合。 ３ 结 语 通过盐酸胍诱导牛血红蛋白变性的量热实验，获取了牛血红蛋白与盐酸胍相互作用的焓效应和牛血 红蛋白的变性随盐酸胍浓度和溶液ｐＨ值的变化规律。利用简单模型对实验结果进行热力学分析，并探讨 了牛血红蛋白与盐酸胍之间的结合作用以及盐酸胍造成牛血红蛋白变性的机理。结果显示，盐酸胍诱导牛 血红蛋白变性的相互作用分为３个阶段：盐酸胍浓度不足２．５ ｍｏｌ・Ｌ 时为第一阶段，牛血红蛋白还未 变性，以自然态存在；盐酸胍浓度在２．５～４．５ ｔｏｏｌ・Ｌ 时为第二阶段，蛋白质结构打开，暴露出原来处十 结构内部的基团，且蛋白质结构打开的吸热效应与盐酸胍分子结合的放热效应有所抵消，热效应变化相对 比较平缓；盐酸胍浓度超过４．５ ｍｏｌ・Ｌ 之后为第三阶段，盐酸胍分子继续与暴露出来的基团进行结合， 导致变性后的直线斜率比变性前的要大。牛血红蛋白在等电点时结构最稳定，且牛血红蛋白与盐酸胍的结 合在弱碱性条件下更易进行。牛血红蛋白的结合位点与盐酸胍分子的结合焓受溶液ｐＨ值的影响，因为溶 液的ｐＨ值影响蛋白质除共价键以外的多种弱相互作用，因此溶液ｐＨ值的变化必然影响蛋白质热力学稳 定性。 参考文献： ［１］ ＢＥＨＢＥＨＡＮＩ Ｇ Ｒ，ＳＡＢＯＵＲＹ Ａ Ａ，ＴＡＩ ＥＳＨＩ Ｅ Ａ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｅｎｔｈａｌｐｙ ｆｏｒ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ａｎｄ ｄｏｄｅｅｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ［Ｊ］．Ｊ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｈｅｍ，２００８，３７（５）：６１９—６２９． ［２］ＳＩＮＧＨ Ｒ，ＤＡＲ Ｔ Ａ，ＡＨＭＡＤ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ—ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｈｅａｔ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃｈａｎｇｅ ａｓ— ｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ｏｒ ｕｒｅａ）ＥＪ］．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ，２００８。１３３（１／３）： 第４期 李向荣等：盐酸胍诱导牛血红蛋白变性的微量热研究 ８１－８９． ［３］ＲＡＭＰＲＡＫＡＳＨ Ｊ，ＤＯＳＥＥＶＡ Ｖ，ＧＡＩ ＫＩＮ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｖ ａ ｔｗｏ—ｓｔａｔｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００８，３７４（１）：２２１—２３０． ［４］ＨＡＵＧ Ｉ Ｊ，ＳＫＡＲ Ｈ Ｍ．ＶＥＧＡＲＵＤ Ｇ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｌａｅｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｈｅａｔ ｄｅｎａｔｕ－ ｒａｔｉｏｎ ａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，２００９，２３（８）：２２８７—２２９３． ［５］ＭＥＩ ＮＩＫ Ｔ，ＰＯＶＡＲＮｌＴｓＹＮＡ Ｔ，ＳＯｌ ＯＮＥＮＫＯ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｈｅａｔ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓ— ｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｔｈｅｒｍｏｃｈｉｍ Ａｃｔａ，２０１１，５１２（１／２）：７１－７５． ［６３ ＭＩＣＨＮＩＫ Ａ。ＤＲＺＡＺＧＡ Ｚ，ＫＬＵＣＺＥＷＳＫＡ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅ— ｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ，２００５，１１８（２／３）：９３－１０１． ［７］沈星灿，刘新艳，梁宏，等．牛血红蛋白与银纳米粒子相互作用的光谱研究［Ｊ］．化学学报，２００６，６４（６）：４６９—４７４． ［８］ＢＡＯ Ｘｉａｏ—ｙｕ，ＺＨＵ Ｚｈｉ－ｗｅｉ，ＬＩ Ｎａｎ－ｑｉａｎｇ，ｅｔ ａ１．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｎｄ ｄｅ— ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ［Ｊ］．Ｔａｌａｎｔａ，２００１，５４（４）：５９１－５９６． ［９］ＣＡＲＬＵＣＣＩ Ｆ，ＭＩＲＡ１ ＤＩ Ｆ，ＢＡＲＲＥＴＴＡ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｅｎｅｒｇｙ ｓｔａｔｕｄ ｂｙ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｉｓｃｈｅｍｉａ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，２００２，５６（５）：２４７—２５３． ［１ Ｏ］ ＷＡＮＧ Ｙａｎ—ｑｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ—ｍｅｉ，ＺＨＡＮＧ Ｇｅｎ—ｃｈｅｎｇ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐａｒａｑｕａｔ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌ，２００７，４１（３）：２４３—２５０． ［１ １］ ｗｕ Ｙｕｎ，ＭＡＯ Ｈｕｉ，ＺＨＡＯ Ｂｏ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｗｉｔｈ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｕｓｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２００９，２３（５／６）：２７１—２７９． ［１２］ＭＹＳＨＫＩＮ Ａ Ｅ，ＫＨＲＯＭＯＶＡ Ｖ Ｓ．Ａ ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｍｅｒｃｅｒｉｚｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２００５，１７４９（１）：１－６． ［１３］ＷＡＮＧ Ｙａｈ—ｑｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ—ｍｅｉ，ＺＨＯＵ Ｑｉｕ—ｈｕｎ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｆｆｅｉｎｅ ｗｉｔｈ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００９，４４（５）：２１００—２１０５． ｒ１ ４］ Ｉ Ｕ Ｙａｎ，ＷＡＮＧ Ｘｉｕ—ｆａｎｇ，ＳＵ Ｇｕｉ—ｊｉｎ，ｅｔ ａ１．Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ｗｉｔｈ ａｌｋａｎｌｏｌ ｉｎ ｗａｔｅｒ ａｔ ２９８．１５ Ｋ［Ｊ］．Ｔｈｅｒｍｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００３．４０６（１／２）：２３３—２３９． ［１５］ＣＨＩＬＯＭ Ｇ，ＣＨＩＬＯＭ Ｏ，ＴＥＬＥＡ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ａ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｕｒｅａ［Ｊ］． Ｒｅｖ Ｒｏｕｍａｉｎｅ Ｃｈｉｍ，２０００，４５（１１）：９８９—９９３． ［１６３李向荣。郭伟，卢雁．牛血清蛋白在盐酸胍和尿素体系中变性的微量热研究［Ｊ］．化学学报，２０Ｏ８，６６（５）：５１５—５１９． Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ＬＩ Ｘｉａｎｇ—ｒｏｎｇ ，ＹＵ Ｊｉｅ ，ＨＡＯ Ｘｉａｏ—ｘｉａｏ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｈｅｎａｎ ４５３００３，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｈｅｎａｎ ４５３００７，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ａｔ ３０。Ｃ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｐＨｓ．Ｔｈｅ ｓｉｍｐｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒｅｅ ｅｎｅｒｇｉｅｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｍｉｄｐｏｉｎｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｗａｓ ａｍ． ｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｅｎｔｈａｌｐｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅ～ ｔｗｅｅｎ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｓ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｓｔａｇｅｓ．Ｔｈｅ ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｅｎｔｈａｌｐｙ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｂｙ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｉｓ ２００ ｋＪ・ｍｏｌ～ａｔ ｐＨ５．２１ ａｎｄ ５４０ ｋＪ・ｍｏｌ‘ ａｔ ｐＨ６．７０，ｗｈｉｌｅ ｉｔ ｉｓ １ ２０ ｋＪ・ｍｏｌ—ａｔ ｐＨ８．０３．ＢＨｂ ｉｓ ｍｏｓｔ ｓｔａｂｌｅ ａｔ ｉｔｓ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐＨ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ；ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ （责任编辑王龙杰）
