第２８卷第５期 影像科学与光化学 １ａｇｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔ Ｖｏ１．２８ Ｎｏ．５ Ｓｅｐｔ．，２０１０ ２０１０年９月 同步荧光法测定大鼠血浆中 牛血清白蛋白的研究 覃光炯 。，高云华 （１．中国科学院理化技术研究所光化学转换与功能材料重点实验室，北京１００１９０； ２．中国科学院研究生院，北京１０００４９） 摘要：以异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白为模型药物，采用同步荧光法 测定了大鼠尾静脉注射模型药物后血浆中药物浓度随时间的变化．系统研究了 样品处理、测试条件等一系列因素对测试结果的影响，建立了一种简单有效的 测定生物体内的微量外源性蛋白质的方法，并与酶联免疫吸附法测定结果进行 了比较，二者的测试结果具有良好的一致性． 关键词：同步荧光法；牛血清白蛋白；血药浓度；酶联免疫吸附法 文章编号：１６７４—０４７５（２０１０）０５—０３５４—０８ 中图分类号：０６５７ 文献标识码：Ａ 许多蛋白质和多肽类物质在临床上具有药效＿１］，可用来治疗某些特定的疾病．随着 生物学技术的飞速发展，越来越多的蛋白质和多肽类药物已被广泛的研究，有的已进入 临床实验阶段Ⅲ２ ］．测定这类药物在给药后的药代动力学参数，特别是血药浓度一时间曲 线，对于判定药物的疗效、确定最优给药剂量、指导临床用药具有重要意义． 蛋白和多肽类药物的药代动力学具有生物半衰期短、血药浓度低等特性，同时生物 体内有大量相似的干扰物质存在，使蛋白和多肽类药物的药代动力学测定更加困难．目 前常用的分析方法主要为免疫分析法［４］、同位素标记示踪法［５］、生物检定法［６］以及一些 理化分析技术如高效液相色谱、质谱、色质联用［７］等．但这些方法都有一些缺陷，如免疫 分析法需要开发相应的抗体，测定时间较长，测定结果在很大程度上受到药物与对应抗 体的反应性的影响；同位素标记法测定需要特定的防护措施；高效液相色谱、质谱测定， 样品前处理步骤复杂，且测试所用仪器均较昂贵． 在药物的前期研究中，大多采用动物实验的方法评价药物的药代动力学Ｅ ｓ， ．本论文 收稿日期：２０１０—０５—１１：修回日期：２０１０—０５—２５．通讯联系人：高云华，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｈｇａｏ＠ｍａｉｌ．ｉｐｃ．ａｃ．ｅｌｌ 作者简介：覃光炯（１９８３一），博士研究生，主要从事药学分析研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｊｑｉｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｎ３．ｃｎ． ３５４ 第５期 覃光炯等：同步荧光法测定大鼠血浆中牛血清白蛋白的研究 ３５５ 拟建立一种快速、灵敏的测定实验动物体内蛋白和多肽类药物血药浓度的分析方法．采 用异硫氰酸标记的牛血清白蛋白（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ）为模型药物，通过对样品处理、测试方法等 一系列条件的摸索，建立了一种采用同步荧光法测定ＦＩＴＣ－ＢＳＡ的大鼠体内药代动力学 的分析方法，并用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）验证了该方法的准确性． １实验部分 １．１仪器与试剂 仪器：Ｆ－２５００荧光分光光度计（日本Ｈｉｔａｃｈｉ公司）；ＲＴ－２１００Ｃ酶标仪（深圳市蕾杜 电子有限公司）；ＥＡＳＹＰｕｒｅ ＬＦ超纯水仪（美国Ｂａｒｎｓｔｅｄ公司）；ＴＧＬ＿１６Ｂ高速离心机 （上海安亭科学仪器厂）． 试剂：异硫氰酸荧光素标记牛血清白蛋白（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ，标记比ＭＦ丌ｃ：ＭＢｓＡ一１．７５， ｐｆｊＳＡ一１５．１２ ｍｇ／ｍＬ，北京成文免疫化学研究室）；牛血清白蛋白酶联免疫试剂盒（无锡 罗益生物技术有限公司）；牛血清白蛋白标准品（中国药品生物制品检定所）；氯化钠、氯 化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均为分析纯试剂，所有实验所用水均为超纯水． １．２大鼠血液的采集以及血清血浆的制备 雄性ＳＤ大鼠（２５０ ｇ）乙醚麻醉之后，采用５．０ ｍＬ注射器心脏取血．血清制备：血液 取出后装入２．０ ｍＬ离心管中，４℃保存，于６ ｈ之内离心，取上清液得到血清．血浆制备： 血液样品取出后装入肝素钠抗凝的离心管中，并立即离心，得到血浆．离心出的血清和血 浆样品如不立即使用，于一２Ｏ℃冷冻保存。 １．３不同浓度ＦＩＴＣ－ＢＳＡ的血清、血浆、缓冲溶液荧光测试 配制ｐＨ一７．４的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）方法：取０．２ ｇ ＫＣ１，０．２ ｇ ＫＨ ＰＯ４，８．０ ｇ ＮａＣ１，０．２９ ｇ Ｎａ２ＨＰ０４・１２Ｈ２Ｏ于１ Ｌ烧杯中，加入９５０ ｍＬ超纯水溶解后，调节ｐＨ 至７．４，然后定容至１．０ Ｌ． 依次用大鼠血清、血浆和ＰＢＳ缓冲液将ＦＩＴＣ－ＢＳＡ溶液分别稀释至０．１、０．５、１．５、 ３．０、５．０、１０．０／￣ｇ／ｍＬ．设定Ｆ－２５００荧光仪的激发波长为４８０ ｎｍ，测定扫描波长范围 ５Ｏ０—７Ｏ０ ｎｍ的荧光发射光谱． １．４普通激发测试与同步荧光测试对比 同步荧光扫描技术与常用的荧光测定方法最大的区别是同时扫描激发和发射两个 单色器波长．由测得的荧光强度信号与对应的激发波长（或发射波长）构成光谱图，称为 同步荧光光谱．恒波长同步荧光法是在扫描过程中使激发波长和发射波长彼此间保持固 定的波长间隔，一般设定该波长间隔等于测定物质的ｓｔｏｋｅｓ位移．恒波长同步荧光光谱 法较多用于多组分物质的测定或者一种组分在常规测试条件下受到较大干扰时的测定， 具有选择性好、灵敏度高、干扰少等特点． 为了对比采用普通激发模式和恒波长同步荧光模式测试对ＦＩＴＣ－ＢＳＡ血浆样品测 定的影响，配制２．５／￣ｇ／ｍＬ的ＦＩＴＣ－ＢＳＡ的血浆样品，并分别采用普通激发模式和恒波 长同步荧光模式测试其荧光光谱图．两种测试模式下Ｆ－２５００荧光分光光度计的参数设 ３５６ 影像科学与光化学 第２８卷 注：ＥＸ：激发；ＥＭ：发射；ＷＬ：波长 １．５ ｐＨ对同步荧光测试的影响 配制质量浓度为１．０／ｘｇ／ｍＩ 的ＦＩＴＣ－ＢＳＡ血浆溶液和ＰＢＳ溶液，另配制ｐＨ分别 为５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．４、７．５、８．０、８．５、９．０的磷酸盐缓冲溶液．取１．０“ｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ－ＢＳＡ的ＰＢＳ溶液和血浆溶液各１００ Ｌ，用上述缓冲溶液分别稀释至１．０ ｍＬ，采用 同步荧光法测定其荧光光谱． １．６血浆稀释对同步荧光测试的影响 取６只大鼠采血，得到血浆．并用每只大鼠的血浆液分别配制０．１、０．５、１．０、２．５、５．０ ｐｔｇ／ｍＬ的ＦＩＴＣ－ＢＳＡ溶液，同步荧光法测定各样品同步荧光光谱．然后每个样品各取 ０．１ ｍＬ用ｐＨ ７．４的ＰＢＳ缓冲液分别稀释至０．５ ｍＬ和１．０ ｍＬ，即将原溶液分别稀释至 ５倍和１０倍，相同荧光测试条件下测定样品的同步荧光光谱． １．７大鼠静脉注射后血药浓度的测定 ８只ＳＤ雄性大鼠（２５０ ｇ）随机分成两组，实验之前至少禁食１２ ｈ以上，但可以自由 饮水．用ｐＨ ７．４的ＰＢＳ缓冲液将ＦＩＴＣ－ＢＳＡ溶液稀释至９Ｏ ｐ￣ｇ／ｍＬ，４只ＳＤ雄性大鼠尾 静脉注射，注射剂量为０．１ ｍＬ／只，另配制浓度为９０ ｔ￣ｇ／ｍＬ的ＢＳＡ标准品溶液，取另一 组４只大鼠各尾静脉注射０．１ ｍＩ ＢＳＡ标准品溶液．注射后第１０ ｍｉｎ、３０ ｍｉｎ、１ ｈ、４ ｈ、７ ｈ、１２ ｈ、２４ ｈ、３６ ｈ、４８ ｈ从大鼠眼眶采血约３００ Ｌ，置于含有少量肝素钠溶液的离心管 中，并立即离心出血浆．血浆样品在一２０℃冷冻保存直至测试． 注射ＦＩＴＣ－ＢＳＡ溶液组大鼠的血浆样品，用ＰＢＳ稀释１Ｏ倍后，利用同步荧光法测定 其荧光光谱，并根据最大发射波长处的荧光强度值和标准曲线计算出血浆中ＢＳＡ的浓 度．注射ＢＳＡ标准品的实验组大鼠则采用酶联免疫吸附法测定血浆样品中ＢＳＡ的浓度． ２结果与讨论 异硫氰酸荧光素为一种优良的荧光探针，具有良好的荧光性质Ｅ加］，其分子中的异硫 氰基可与蛋白质的氨基发生化学反应，从而将蛋白质标记上荧光探针．在体外实验和动 物实验中，使用荧光标记可以大大简化检测蛋白质的方法和步骤． ２．１ ＦＩＴＣ－ＢＳＡ血清溶液、血浆溶液、ＰＢＳ缓冲液荧光对比 在普通的激发模式下，采用４８０ ｎｍ波长的光激发ＦＩＴＣ－ＢＳＡ溶液，荧光发射光谱最 第５期 覃光炯等：同步荧光法测定大鼠血浆中牛血清白蛋白的研究 ３５７ 大发射波长为５１８ ｎｍ．图１为０．１、０．５、１．５、３．０、５．０、１０．０￣ｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ－ＢＳＡ的血清、 血浆以及ＰＢＳ溶液在５１８ ｎｍ处的荧光强度一质量浓度图．从图中可以看出，ＦＩＴＣ－ＢＳＡ 质量浓度较低时，血清和血浆样品的荧光强度明显高于ＰＢＳ缓冲液；在ＦＩＴＣ－ＢＳＡ质量 浓度较高时，荧光强度差别不大，说明血清和血浆样品中的其他蛋白对ＦＩＴＣ－ＢＳＡ的荧 光测试有较大的影响．低质量浓度时，由于血清和血浆液的荧光光谱背景值较高，可能导 致ＦＩＴＣ－ＢＳＡ的荧光发射峰被湮没，从而降低了测试的灵敏度．因此，降低血清和血浆中 其它物质的干扰，提高样品的荧光响应是测定低浓度样品必须解决的问题． 如 印 如 Ｏ 占ＩｓＩＩ ｌｕ— ｕＩ】 Ｑ呐２０；一 ｏ ２ ４ ６ ８ １０ ＰＢＳＡ（／＊ｇ／ｍＬ） 图１不同质量浓度的ＦＩＴＣ－ＢＳＡ血清、血浆及ＰＢＳ溶液荧光强度一质量浓度图 Ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｖｓ．ＦＩＴＣ ＢＳＡ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｒｕｍ，ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ＰＢＳ 将图１中不同质量浓度的ＦＩＴＣ－ＢＳＡ血清溶液、血浆溶液和ＰＢＳ溶液荧光强度一质 量浓度曲线外推至ＢＳＡ质量浓度为零时，对应的荧光强度分别为３２．５，３０．１和０．２．表 明血浆样品中其他物质的背景干扰比血清样品的小，但是血清和血浆溶液背景均明显高 于ＰＢＳ溶液的背景．图１还显示，在ＦＩＴＣ－ＢＳＡ质量浓度相同时，血浆样品的荧光强度均 高于血清样品且血浆样品荧光强度～浓度曲线的斜率较大，说明血浆样品中ＦＩＴＣ－ＢＳＡ 荧光强度对浓度的响应更大．因此，在后续研究中均采用血浆溶液进行测试． ２．２恒波长同步荧光法测试结果 测定ＦＩＴＣ－ＢＳＡ血浆溶液的三维荧光谱图，发现ＦＩＴＣ－ＢＳＡ的荧光Ｓｔｏｋｅｓ位移为 ２３ ｎｍ，因此选择激发光波长和发射光波长相差２３ ｎｍ对ＦＩＴＣ－ＢＳＡ血浆样品进行同步 荧光法测定。对ＦＩＴＣ－ＢＳＡ质量浓度为２．５ ｔ￣ｇ／ｍＬ的血浆样品，采用常用的固定发射波 长扫描法，ＦＩＴＣ－ＢＳＡ的荧光发射峰基本被湮没；采用同步荧光法测试，谱图出现了明显 的荧光发射峰，最大发射波长处的荧光强度也明显增加（图２）．表明采用同步荧光法测 试，能明显降低其他物质的干扰，增加最大发射波长处的荧光强度，且荧光谱图的峰形较 好，适合于低浓度样品的分析． 同步荧光法具有选择性好、灵敏度高、干扰少等特性，可用于多组分物质的分 析口 ］．由于激发波长和测定的发射波长同时变化，因此能有效的降低干扰．在本研究 中，采用同步荧光法，可以明显减少血浆中其它物质对ＦＩＴＣ－ＢＳＡ荧光测试的干扰． ３５８ 影像科学与光化学 第２８卷 扫ｌｓ 菪一 ０口 曲２０Ｔ１一 Ｏ Ｏ 扫 ０ 菪一 ｕＬ１ ｕ曲 ｊｏｆ１一 Ｈ Ｏ ７ Ｏ 如 加 ０ ５２０ ５６０ ６００ ６４０ ６８０ Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ／ｎｍ 图２质量浓度为２．５￣ｇ／ｍＬ的血浆样品的荧光发射光谱图和同步荧光光谱图 Ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ＦＩＴＣ－ＢＳＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ２．３ ｐｉｔ的影响 采用同步荧光测试法，在相同样品浓度和测试条件下，ＦＩＴＣ－ＢＳＡ血浆溶液和ＰＢＳ 溶液在不同ｐＨ条件下测得的荧光强度不同，表明溶液的ｐＨ值会影响ＦＩＴＣ的量子产 率［１引．在碱性环境下，不论是ＦＩＴＣ－ＢＳＡ的血浆溶液，还是ＰＢＳ溶液，ＦＩＴＣ的量子产率 明显高于在酸性环境中的量子产率（图３）．因此，利用同步荧光法测定血浆样品中的蛋白 浓度时，应尽量使样品的ｐＨ保持一致．生理环境的ｐＨ为７．４，所以后续实验均将溶液的 ｐＨ调至７．４后测试． ５ ６ ７ ｐＨ ８ ９ 图３ ＦＩＴＣ－ＢＳＡ血浆溶液和ＰＢＳ溶液在不同ｐＨ环境中的荧光强度 Ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＶＳ．ｐＨ ｏｆ ＦＩＴ＠ＢＳＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｏｒ ＰＢＳ ２．４血浆样品的稀释测定 在动物实验的给药研究中，动物的生理状态不同，可能会导致血浆中对荧光测试有 干扰的物质含量不同，同时，ｐＨ值也直接影响荧光强度．根据图１，由于ＰＢＳ溶液中未含 有血清和血浆中的物质，因而荧光测试时背景干扰较小，将血清和血浆采用ＰＢＳ溶液稀 释，有可能降低其它物质的干扰．因此，为了使同步荧光测试的结果更接近实际，我们考 察了采用ｐＨ一７．４的ＰＢＳ缓冲液对血浆进行稀释后测定的方法，评价了６只大鼠的 第５期 覃光炯等：同步荧光法测定大鼠血浆中牛血清白蛋白的研究 ３５９ ＦＩＴＣ－ＢＳＡ血浆样品在不稀释、稀释５倍和稀释１０倍时的荧光强度一质量浓度关系． １８Ｏ ８０ ‘ 害 ｄ ．薹 ｏ ０ 量 ６０ 扫 ＩＪ ｌｕ—ｏ０ ∞２０ ．ｌ １２０ 盘 ∞ 呈 。 ０ １ ２ ３ ４ ５ ２ ４０ ０ 也 ∞ 如 加 ｍ 三 ２０ ０．０ ０．２ ０．４ ０．６ ０．８ １．０ ＰＢＳＡ（￣ｇ／ｍＬ） ＰＢＳＡ（ｔ￣ｇ／ｍＬ） ０．０ ０．１ ０．２ ０．３ ０．４ ０．５ ＰａｓＡ（ｂＬｇ／ｍＬ） 图４六只大鼠的ＦＩＴＣ－ＢＳＡ血浆溶液在（ａ）未稀释、（ｂ）ＰＢＳ溶液稀释５倍和（ｃ）１０倍时的荧光强度一质量浓度图 Ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＶＳ．ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＩＴＣ－ＢＳＡ （ａ）ｐｌａｓｍａ，（ｂ）×５ ｄｉｌｕｔｅｄ ｂｙ ＰＢＳ，（ｃ）×１０ ｄｉｌｕｔｅｄ ｂｙ ＰＢＳ 图４ａ表明，６只不同大鼠血浆溶液在未稀释时的荧光背景值差异很大，且荧光强度 对ＦＩＴＣ－ＢＳＡ浓度的响应（图中各线的斜率）也不相同，将血浆液采用ＰＢＳ溶液稀释５倍 之后，图中每条线的斜率差异减小（图４ｂ），当采用ＰＢＳ溶液将血浆样品稀释１０倍后，图 中各线的斜率基本相同（图４ｃ）．这是因为采用ＰＢＳ稀释之后，血清和血浆中其它蛋白类 物质也被稀释，其对ＦＩＴＣ－ＢＳＡ荧光测试的干扰会降低，从而使荧光强度一质量浓度曲线 的斜率趋于一致。上述结果表明，采用ＰＢＳ稀释大鼠的血浆样品，可以降低不同大鼠之 间的差异．对同一批实验动物，可以只做一条荧光强度一浓度标准曲线，得到斜率相同的标 准曲线Ｙ—ｋＸ＋Ｚ，其中ｙ为同步荧光法测定荧光谱图中最大发射峰处的荧光强度，Ｘ 为ＦＩＴＣ－ＢＳＡ质量浓度，ｚ为大鼠空白血浆稀释１０倍后的荧光强度，是为标准曲线的斜 率．在本研究的测试条件中，我们得到的ｋ一１５．１９，对于不同的仪器、不同的荧光标记 物，ｋ值不同． ２．５测试方法的验证 为了验证上述测试方法的正确性，分别对大鼠进行ＦＩＴＣ－ＢＳＡ和牛血清白蛋白标准 品尾静脉注射，并分别采用本研究中建立的方法和酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）Ｅ 测定给药 ３６０ 影像科学与光化学 第２８卷 后大鼠血浆液中ＢＳＡ的质量浓度，将同一实验组中４只大鼠测定的血浆中ＢＳＡ质量浓 度进行平均，计算平均值和标准偏差，并对时间作图．图５表明，二者测定的结果具有很 好的一致性，说明本研究中建立的测试方法是准确可靠的． 晕 １６ 竺 ∞ 《 １２ ∞ 口 ．２ 董 菪 ８ ｃ ８ 一 昌 蛊 ０ ｌＯ ２Ｏ ５０ 图５大鼠尾静脉注射ＦＩＴｃ＿ＢＳＡ及ＢＳＡ标准品后血药浓度一时间图 Ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＩＴＣ－ＢＳＡ ａｎｄ ＢＳＡ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｆｔｅｒ ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ 本研究建立了一种快速、简单测定生物体中外源性蛋白质的方法，对于蛋白和多肽 类药物动物实验的药代动力学分析具有重要意义．采用酶联免疫吸附法测定不同的蛋白 质时，需要制备每种蛋白的特异性抗体，并需要采用特定的反应和显色系统，测定时间 长，所需试剂均较昂，而且目前的酶联免疫试剂盒均只能针对特定的蛋白质进行测定．而 采用ＦＩＴＣ标记蛋白质的技术已经很成熟，几乎所有的蛋白质均能采用ＦＩＴＣ进行标记， 因此，本方法可适合于所有蛋白类药物的测试．相对于酶联免疫吸附法、放射性标记等， 本方法还具有样品处理简单、测试快速灵敏、不需要特殊防护等优点． ３结论 本文采用异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白为模型药物，采用恒波长同步荧光 法，建立了一种简单、快速、灵敏的测定蛋白类药物给药后血药浓度的分析方法．研究结 果表明：选择血浆样品进行测试比血清效果好；用ｐＨ＝＝＝７．４的ＰＢＳ缓冲溶液对血浆样 品进行稀释，可以有效的减少测试误差；同时，利用同步荧光法可以有效的降低血浆样品 中其他物质荧光测试的干扰．在相同的测试条件下，同一批实验可以建立一个斜率相同 的荧光强度一样品质量浓度标准曲线．酶联免疫吸附法证明采用本研究中的方法能准确测 定蛋白质的血药浓度． 参考文献： ［１］Ｈｏｐｋｉｎｓ Ａ Ｌ，Ｇｒｏｏｍ Ｃ Ｒ．Ｔｈｅ ｄｒｕｇｇａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．，２００２，１（９）：７２７—７３０ ［２］Ｄｒｅｗｓ Ｊ．Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：ａ ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８７（５４６０）：１９６０—１９６４． 第５期 覃光炯等：同步荧光法测定大鼠血浆中牛血清白蛋白的研究 ３６１ ［３３ Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ Ｖ Ｐ，Ｌｕｋｙａｎｏｖ Ａ Ｎ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ａｎｄ ｉｎｔｏ ｔｕｍｏｒｓ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ［Ｊ］．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，２００３，８（６）：２５９—２６６． ［４］Ｅｎｇｖａｌｌ Ｅ．Ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ＥＭＩＴ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ１．，１９８０，７０（Ａ）：４１９． ［５］李高．稳定同位系标记药物在ｌ临床药代动力学研究中的应用［Ｊ］．中国临床药理学杂志，２０００，１６（１）：５８—６２． Ｌｉ Ｇ．Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏ１．，２０００，１６（１）：５８－６２． ［６］Ｍｅａｇｅｒ Ａ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２，２６１（１）：２１—３６． ［７］张琪，王广基．蛋白多肽类药物药代动力学分析方法研究进展ＬＪ］．药物生物技术，２０００，７（２）：１２６—１２８． Ｚｈａｎｇ Ｑ，Ｗａｎｇ Ｇ Ｊ．Ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］． Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．，２０００，７（２）：１２６—１２８． ［８］Ｗｏｏｄｎｕｔｔ Ｇ，Ｂｅｒｒｙ Ｖ．Ｔｗｏ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ－ｃｌａｖｕｌａｎａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ［Ｊ］．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． ＡｇｅｎｔｓＣｈ．，１９９９，４３（１）：２９． ［９］Ｋｏｏｐｍａｎｓ Ｓ Ｊ，ｗｅｅ＿Ｐａｌｓ Ｌ Ｖ Ｄ，Ｌｏｗｉｋ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｅｏｄｙｎａｍｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｂｉｓｐｈ０ｓｐｈ０ｎａｔｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ （；ｌａｂｅｌｅｄ １一ｈｙｄｒｏｘｙ－３一（１一ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙ１）一ｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ－１，１一ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ［Ｊ］．Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ．，２００９，９（２）：２４１—２４６． ［１０］Ｗｅｉｓｓ Ｈ Ｒ．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，１９８８， ３６（２）：１７２—１８０． ［ｕ］Ｃａｂａｎｉｓｓ Ｓ Ｅ Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｍｅｔａｌ—ｆｕｌｖｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏ１．， １９９２，２６（６）：１１３３—１１３９． ［１２］Ｐａｔｒａ Ｄ，Ｍｉｓｈｒａ Ａ Ｋ．Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉ—ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］． ｎＡＣ－Ｔｒｅｎｄ．Ａｈａ１．Ｃｈｅｍ．，２００２，２１（１２）：７８７—７９８． ［１３］Ｌｏｒｅｎｚ Ｊ，Ｇｒｕｅｎｓｔｅｉｎ Ｅ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ，ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｓｉｎｇｌ￣ｎｅｐｈｒｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｕｓｉｎｇ ＦＩＴ（；ｉｎｕｌｉｎ［Ｊ］．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏ１．一Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏ１．，１９９９，２７６（１）：Ｆ１７２一Ｆ１７７． Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎ Ｒａｔ Ｐｌａｓｍａ ｂｙ Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ＱＩＮ Ｇｕａｎｇ－ｊｉｏｎｇ ，ＧＡＯ Ｙｕｎ－ｈｕａ （１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９０，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ； ２．ＧｒａｄｕａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅ（１ｉｎｇ １０００４９，ＰＲ．Ｃｈｉａ）ｎ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ）ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｄｒｕｇ，ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＩＴＣ－ＢＳＡ ｉｎ ｒａｔ ｐｌａｓｍａ ｗａｓ ａｓｓａｙｅｄ ａｆｔｅｒ ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ｗｈｏｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｍａｔｃｈ ｗｉｔｈ ｒｅｓｕｌｔｓ ｂｙ ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｖｅｒｙ ｗｅｌ１． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ￣ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＧＡＯ Ｙｕｎ－ｈｕａ
