世界最新医学信息文摘２０１４年第１４卷第１３期 ・１６９ 医学检验・ 浅谈电化学发光免疫法测定抗ＨＣＶ－ＩｇＧ 王文杰 （黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨１５０００１） 摘要：目的探讨电化学发光免疫法测定抗ＨＣＶ－ＩｇＧ的原理及方法。方法采用双抗体夹心法原理进行测定。结论电 化学发光免疫法测定抗ＨＣＶ－ＩｇＧ安全有效，值得在临床推广使用。 关键词：检测检验；免疫；抗体 中图分类号：Ｒ４４６ 文献标识码：Ｂ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１—３１４１．２０１４．１３．１２７ １原理 采用双抗体夹心法原理。第一步：４０ ｌ样本、６０ ｌ 生物素化ＨＣＶ抗原及６０ｔＡ钌复合体标记ａ的ＨＣＶ抗原一 起孵育，反应形成“三明治”样抗原一抗体复合体。第二步： 加入链霉亲和素包被的微粒，让上述形成的复合物通过生 物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。第三步：反应 混和液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结 合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通 过光电倍增管进行测定。Ｅｌｅｃｓｙｓ自动将标本产生的光电信 号与从ＨＢｓＡＧ定标液得出的Ｃｕｔ—ｏｆｆ值相比较。 ２标本采集 采集无抗凝静脉血２ ３ｍｌ，也可使用肝素锂、 ＥＤＴＡ—Ｋ３或草酸钠抗凝血浆。按标本签收程序签收。不能 及时检测的标本可于２～８℃保存。 ３试剂 ３．１试剂来源 德国罗氏公司原装配套试剂。 ３．２试剂组成 ３．２．１ Ｍ 包被链霉素的磁珠微粒（透明瓶盖），每瓶６．５ｍｌ；包被 链霉素的磁珠微粒，０．７２ｍｇ／ｍｌ。含防腐剂。 ３．２．２ Ｒ１ 缓冲液（灰色瓶盖），每瓶７ｍｌ，ＨＥＰＥＳｂ缓冲液， ｐＨ５．０；Ｒ２缓冲液（黑色瓶盖），每瓶７ｍｌ，ＨＥＰＥＳ缓冲液， ｐＨ５．０。 ３－２＿３ Ｒｌａ 冻干的生物素化ＨＣＶ抗原（白色瓶盖），每瓶加Ｉ．２ｍｌ 溶解液溶解；Ｒ２ａ冻于的钌复合物标记ＨＣＶ抗原（黑色瓶 盖），每瓶加１．２ｍｌ溶解液溶解。 ３．２．４其他 Ｒｉｂ及Ｒ｜ａ的溶解液（白色瓶盖），每瓶１．４ｍｌ水，经过 防腐处理；Ｒ２ｂ及Ｒ２ａ的溶解液（黑色瓶盖）每瓶１．４ｍｌ水， 经过防腐处理。 ３．３校准品 Ｃａｌ ｌ：阴性定标液（白盖１２瓶，ｌｍｌ／瓶人血清，含防腐剂。 Ｃａｌ２：阳性定标液（黑盖１，２瓶，每瓶１．３ｍｌ，人抗ＨＣＶ抗 体阳性血清，经过防腐处理。对于ＨＢｓＡＧ和抗一ＨＩＶ １／２无 反应。 ３．４质控品 Ｅｌｅｃｓｙｓ ＨＣＶ ｃｏｍｂｉ质控品１和２（ｐｒｅｃｉｃｏｎｔｒｏ１）。 ３．５其他所需辅助试剂 Ｅｌｅｃｓｙｓ通用稀释液，Ｅｌｅｃｓｙｓ系统缓冲液ｆｐｒｏＣｅｌ１）， Ｅｌｅｅｓｙｓ测量池清洗液（ｃｌｅａｎＣｅｌ１），Ｅｌｅｃｓｙｓ添加剂液 （ｓｙｓＷａｓｈ），Ｅｌｅｃｓｙｓ系统清洗液（ｓｙｓＣｌｅａｎ）。 ４仪器 德国罗氏公司Ｅ６０１电化学发光免疫分析仪。 ５校准程序 每批ＨＣＶ ｃｏｍｂｉ试剂盒必须用新鲜试剂盒ＨＢｓＡｇ Ｃａｌ ｌ、 Ｃａｌ ２校准一次。另外，以下情况需要再次校准：同一批号 试剂使用１个月。一盒试剂在仪器上放置时间超过７ｄ。系 统误差造成的质控失控。 在编辑各项目的参数时，已经在Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ—Ｃａｌｉｂ菜单 中定义好了校准类型和几点校准。因此在对各项目进行校准 时，只需在校准菜单Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ中进行即可。进入ｃａｌｉｂｒａ— ｔｉｏｎ—ｓｔａｔｓ菜单，用鼠标选择需校准的项目，再根据需要点 单点校准（ＢＬＡＮＫ键）或两点校准（ＴＷＯ ＰＯＩＮＴ键）、跨距 校准（ＳＰＡＮ键）、多点校准（ＦＵＬＬ键），再选择其他项目进 行相应选择，最后点ＳＡＶＥ，将校准物放人在Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ— Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ中定义好的位置，点Ｓｔａｒｔ，再点Ｓｔａｒｔ，仪器开始 校准。 ６操作步骤 ６．１样本检测程序 单个样本输入，在主菜单下选择Ｗｏｒｋｐｌａｃｅ～Ｔｅｓｔｓｌｅｃｔｉｏｎ， 在Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＯ．栏输入标本号，然后选择该标本所需做的单个 项目或组合项目，点ＳＡＶＥ键，样本号自动累加。 批量常规标本的输入，在主菜单下选择Ｗｏｒｋｐｌａｃｅ— Ｔｅｓｔｓｌｅｅｔｉｏｎ，在Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ＮＯ．栏输入起始标本号，然后选择 该标本所需做的单个项目或组合项目，点ＲＥＰＥＡＴ，输入 该批标本的最后一个标本号，点ＯＫ即可。 ６．２进样分析 将标本按在Ｗｏｒｋｐｌａｃｅ菜单中输入的标本号顺序在样本 架上排好，放入进样盘内，按ＳＴＡＲＴ键，输人该批上机标本 的起始标本号，再点ＳＴＡＲＴ键，仪器自动开始推架检测标本。 ６．３计算方法 仪器会自动根据Ｃａｌ ｌ和Ｃａｌ ２的测定值计算Ｃｕｔ—ｏｆｆ值。 每一个标本的结果以有反应性或无反应性及Ｃｕｔ—ｏｆｆ指数形 式（标本信号／Ｃｕｔ—ｏｆｆ）报告。 ７质量控制 ７．１室内质控 用质控品１和质控品２，至少每２４ｈ或每一次校准后测 定一次。质控间隔期应适用于各实验室的具体要求。检测 值应落在确定的范围内，如出现质控值落在范围以外，应 采取纠正措施。 ７．２具体操作 参考罗氏电化学发光操作程序。 ８结果解释 样本的ＣＯ１值＜０．９判断为无反应性。样本的ＣＯＩ值 ≥１．０判断为有反应性。所有初次检测有反应性的样本必须 重复双份检测。样本的ＣＯｌ值≥０．９且＜１．０判断为临界值。 所有临界样本必须重复双份检测。如果二次结果均为无反 应性，样本可判断为抗一ＨＣＶ阴性。如果重复检测结果均 为有反应性或一个有反应性、一个临界，则该样本判断为 重复有反应性。重复有反应性的样本必须进行补充试验（如 免疫印迹分析或ＨＣＶ ＲＮＡ检测）。如果重复检测结果均为 临界或一个无反应性，一个临界，则建议随访。 １７０ 世界最新医学信息文摘２０１４年第１４卷第ｌ３期 Ａｎｔｉ—ＨＣＶ抗体检测能提示当前或以往感染丙型肝炎病毒， 但不能区分是急性、慢性或感染恢复。必须认识到当前可 靠的Ａｎｔｉ—ＨＣＶ检测方法的灵敏度均不足以检测出全部潜在 感染ＨＣＶ的个体。可能由于抗体浓度低于检测下限或者抗 体对试剂使用的抗原不反应。另外，Ｅｌｅｃｓｙｓ Ａｎｔｉ—ＨＣＶ检 测不能完全排除非特异性的结果。 ９分析性能 ９．１分析特异性 使用Ｅｌｅｃｓｙｓ Ａｎｔｉ—ＨＣＶ试剂盒检测含有可能干扰物质 的７７４份样本：含有抗一ＨＢＶ、ＨＡＶ、ＨＥＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ、 ＨＩＶ、弓形虫、风疹和密螺旋体抗体；含有自身抗体及高滴 度的类风湿因子、ＩｇＧ、ＩｇＭ或ＩｇＡ抗体；ＨＢｓＡＧ和Ｅ大肠 埃希菌阳性；ＨＢＶ和流感疫苗接种后；非病毒性肝病。 ９．２精密度 应用Ｅｌｅｃｓｙｓ试剂盒、人血清样本和质控品验证重复性 ｆ村Ｅ内ｎ＝２１，拈Ｅ间１３－１０）ＭＯＤ—ＵＬＡＲ ＡＮＡＬＹＴＩＣＳ Ｅｌ７０分 析仪上按照ＣＬＳ１的ＥＰ５一Ａ执行，每天６次，共１０ｄ（ｎ＝６０）。 １ｌ临床意义 丙型肝炎病毒于１９８９年被首次证实，是一种全球流行 的非甲、非乙型肝炎，输血是其最主要的感染途径。ＨＣＶ 感染常导致慢性肝炎和肝硬化，并可能进展为肝细胞肝癌。 临床常伴有冷球蛋白血症和各种风湿性疾病的症状表现…。 丙型肝炎病毒是黄病毒科的一种单链正股ＲＮＡ病毒， 有衣壳。病毒基因组长约９．５ｋｂ，编码包括结构区和非结构 区在内的３ ０００个氨基酸多肽。如同其他ＲＮＡ病毒，ＨＣＶ ｌ０干扰因素 检测结果不受黄疸（胆红素＜８５５ｔＬｍｏｌ／Ｌ或＜５０ｍｇ／ｄｌ１， 溶血（血红蛋白＜１．０９ｍｍｏｌ／Ｌ或＜１．７５９／ｄＤ，脂血（脂肪乳 剂＜２ １００ｍｇ／ｄ１）和生物素（＜５０ｎｇ／ｍ１）的影响。回收率标准。 在复制过程中发生变异而形成多种变异株。全世界至少报 阳性样本回收率在初始值的－４－２０％之内，阴性样本的ＣＯＩ 道了ｌ１个不同的基因型和多种亚型以及病毒变异体。不同 值≤０．５。对于接受高剂量生物素治疗的患者（＞５ｍｇ／ｄ），必 基因型的病毒可能影响疾病的严重程度和治疗效果。丙型 须在末次生物素治疗８ｈ后采集样本。浓度达１ ０００Ｕ／ｍｌ的 肝炎病毒主要通过被污染的血液和血制品传播，通过人体 类风湿因子对检测无影响。Ｅｌｅｃｓｙｓ Ａｎｔｉ—ＨＣＶ检测未发现 液传播的概率较小 ］。 高浓度钩状效应导致的假阴性反应。体外对１８种常用药物 Ａｎｔｉ—ＨＣＶ抗体检测可单独使用或与其他检测（如ＨＣＶ— 和２种用于治疗ＨＣＶ的药物进行试验未发现有影响。由于 ＲＮＡ）联合使用，检测个体是否感染丙型肝炎病毒和筛选被 检测试剂中含有单克隆鼠抗体，因此，某些接受单克隆鼠 ＨＣＶ污染的血液和血制品。Ｅｌｅｃｓｙｓ Ａｎｔｉ—ＨＣＶ试剂盒使用重 抗体治疗或诊断的患者样本检测结果可能有误。少数病例 组的核心区ＮＳ３和ＮＳ４蛋白肽抗原来检测Ａｎｔｉ—ＨＣＶ抗体。 中极高浓度的链霉素抗体会影响检测结果。由于从病毒感 参考文献 染到血清学表现需要较长时间，因此在感染早期可能出现 ［１］赵利霞，李振甲，魏彦林．化学发光免疫分析Ｉ Ｊ１．世界科技研究与 Ａｎｔｉ—ＨＣＶ阴性的检测结果。若怀疑急性丙型肝炎病毒感 发展，２００４（０４）． 染，则通过反转录聚合酶链扩增（ＲＴ—ＰＣＲ，如使用Ｃｏｂａｓ ［２］农天雷．常用化学发光免疫分析技术及其特点【Ｊ］．现代医药卫生． Ａｍｐｌｉｃｏｒ１进行ＨＣＶ ＲＮＡ检测可以确定是否感染ＨＣＶ。 ２０ｌｌ（１ ４１ （上接第１ ６６页） 升高而形成ＣＡＳ，一般好发在冬季，可有紫绀表现，女性 参考文献 多见。大多数病人体内有冷凝集索存在，杨世明等调查了 【１］周蕾，郭宁茹．冷凝集素综合征合并伤寒、脓肿、骨髓炎一例［Ｊ】． ４９８名病人的血清结果发现共有３２４人含有冷凝集素。由 天津医药，２００９，３７：１６０—１６０． 于冷凝集素的存在，临床中的一些检测结果常会产生误差， 【２】乐家新，马骏龙，徐菡，等．红细胞冷凝集对不同类型血细胞分 影响最大的是血常规测定。在其效价低于ｌ：３２时不会产生 析仪检测结果的影响探讨『Ｊ１．医疗卫生装备，２００９，３０（２）：６９—７１． 冷凝集，额日高于１：６４时则会产生，尤其是超过１：２５６时。 『３］孟令章．冷凝集素干扰血细胞分析仪多项检测参数２例［ＪＪ．临床 有报道显示ＣＡＳ把病人常有贫血症状，冷凝集素对病人的 和实验医学杂志，２００８，７（２）：１７１—１７２． 影响程度有很大差别，为了降低其对血常规检查的影响，在 『４］曾令军，李莉，吴庆，等．高效价冷凝集素对血常规检测结果的 检测之前要进行试剂、标本双加温，以消除冷凝集素的作用， 影响及消除方法探讨【Ｊ】．罕少疾病杂志，２０１１，１８（５）：２－６． 提高检测结果的准确性。 （上接第１ ６７页） 为强阳性，所以ＣＫ１９是有效诊断甲状腺良恶性结节的有力 ２４１． 依据。Ｇａｌ一３是一种Ｂ一半乳糖苷结合蛋白，多参与生理以 ［２】Ｍｉｅｔｔｎｅｎ Ｍ，Ｋｏｖａｔｉｃｈ ＡＪ．Ｋｅｒａｔｉｎ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ａｎｄ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ 及病例的发生过程，在本次的研究中发现Ｇａｌ一３在甲状腺 ｔｈｙｒｏｉｄ ｌｅｓｉｏｎｓ：ａ ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ【ＪＪ． 良恶性结节组织中大多数也为弱阳性或阴性，而在乳头状 Ｖｉｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ，２０１２，４３１（１０１：４０７—４１３． 癌中则多表现为强阳性。ＨＢＭＥ一１是间皮细胞表面微绒毛 ［３】Ｃｏｏｐｅｒ ＤＳ，Ｄｏｈｅｒｔｙ ＧＭ，Ｈａｕｇｅｎ ＢＲ，ｅｔ ａ１．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ 的一种抗原成分，有关研究表明ＨＢＭＥ一１是一种甲状腺乳 ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｙｒｏｉｄ ｎｏｄｕｌｅｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ ＩｊＪ＿ 头状癌的标记物，且在本次的研究中可以发现ＨＢＭＥ一１在 Ｔｈｙｒｏｉｄ，２０１２，１６（２）：１０９—１４２． 乳头状癌中的阳性为１００％，对于甲状腺结节的鉴别诊断有 ［４１ Ｂａｌｏｃｈ ＺＷ，Ａｂｒａｈａｍ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎｓ 着很好骗的辅助作用，而将三者进行联合检测对于甲状腺 ｉｎ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａｎ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ 良恶性结节的诊断与鉴别有着很好的临床实用价值。 ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｕｔｉｌｉｔｙ［ＪＩ＿ＨｕｍＰｍｈｏｌ，２０１２，３０（１０）：１１６６—１１７１． 参考文献 【５】陈丽荣．甲状腺癌分子病理和免疫组化标志物研究进展Ⅲ．实用 ［１】胡盂均，郦秀芳，魏建丽，等．甲状腺肿瘤ＣＯＸ一２、ＣＫ１９和 肿瘤杂志，２０１１，２１（４）：２８７—２８９． ＴＰＯ表达及其意义ＩＪ１．临床和实验病理学杂志，２０１３，２２（２）：２４０一
