泡桐花提取物广谱抑菌性能的研究

冯亦平;程杰瑞;陈丽君;牛颜冰

【摘 要】随着科技的进步和人们生活水平的提高,食品防腐问题越来越受到大家的关注.近年来,人们逐渐发现化学防腐剂对人体健康存在巨大的危害,于是开始致力于绿色、安全、广谱、高效的天然防腐剂的开发.本研究以黑曲霉、桔青霉、黑根霉、米曲霉、绿色木霉、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌为供试菌种,采用菌丝生长速率法和滤纸片扩散法研究了其抑菌性能.结果表明:泡桐花无水乙醇提取物具有广谱的抗菌性能,对黑曲霉、米曲霉、黑根霉和绿色木霉的EC50值分别为7.33 g·L-1、14.15 g·L-1、13.11 g·L-1和9.71 g·L-1,对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的最低抑菌浓度(MIC)值分别为5.0g·L-1、10.0g·L-1和10.0g·L-1,最低杀菌浓度(MBC)值分别为10.0 g·L-1、20.0g·L-1和20.0 g·L-1.综上所述,泡桐花对食品防腐中常见的菌种具有较强的抑制活性,是一种质优价廉的材料,作为天然食品防腐剂具有很大的开发潜力. 【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》 【年(卷),期】2014(034)006 【总页数】6页(P571-576)

【关键词】天然防腐剂;泡桐花;抑菌性能 【作 者】冯亦平;程杰瑞;陈丽君;牛颜冰

【作者单位】山西农业大学校医院,山西太谷030801;山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801;山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801;山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801

【正文语种】中 文 【中图分类】TS201.2

近年来，世界范围内因腐烂变质而对农副产品、果蔬等食品引起的经济损失巨大。因此，研发安全无毒、高效、经济的新型食品防腐剂将是食品工业今后的重要任务[1]。传统的防治方法如腌制、干制、加热等，其缺点在于处理后会影响食品的风味，而冷冻干燥、微波杀菌、辐射保藏等技术投资成本高。因此，使用食品防腐剂是防止食品变质的重要手段[2]。根据来源不同，食品防腐剂可以分为化学合成防腐剂和天然防腐剂两大类。而化学合成防腐剂存在一定的毒副作用。所以，天然食品防腐剂已成为开发的重点。因为，天然的防腐剂不但能够达到化学合成防腐剂的效果，还具有一定的营养价值，而且对人体健康无害[3]。目前，在国内外，天然食品防腐剂的研究已成为科技工作者研究的热点，并已获得可喜的成果[4]。 泡桐花为玄参科植物泡桐(Paulowniatomentosa(Thunb.)Steud.)的花。泡桐主要分布于甘肃、陕西等地。泡桐花春季开花时采收，资源相当丰富，晒干或鲜用[5]。依据目前研究结果，泡桐花中含有黄酮类、生物碱、有机酸、氨基酸、挥发油、蛋白质、多糖、酚类及鞣质类成分[6]，其中黄酮、糖苷类及萜类物质具有抗菌、消炎、止咳、平喘等作用。

本研究将以黑曲霉、桔青霉、黑根霉、米曲霉、绿色木霉、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌为供试菌种，采用菌丝生长速率法和滤纸片扩散法研究泡桐花抑菌性能，旨在为天然食品防腐剂方面做出基础的研究。 1.1 材料

原料为泡桐花，大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella

enteritidis)、黑曲霉(Asppergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、桔青霉

(Penicillium citrinum)、绿色木霉(Trichoderma viride)和黑根霉(Rhizopus nigricans)。以上菌种均由山西农业大学食品学院生物工程系微生物实验室提供。 试剂为无水乙醇、酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl、NaOH、葡萄糖、琼脂。培养基为LB液体培养基、LB固体培养基、PD培养基。 1.2 泡桐花粗提物的制备

选择长势良好的泡桐花，剔除泡桐花中的杂质及霉变品，漂净后，将泡桐花分别置于木板箱，于室内阴凉通风处自然干燥，使用微型植物粉碎机(30～120目)将阴干后的泡桐花磨制为细粉。然后用20倍体积的无水乙醇超声提取，提取条件：40 ℃、功率100%、超声时间1 h，重复3次。接着使用布氏漏斗进行抽滤，取滤液。最后在40 ℃下，将所得滤液浓缩呈膏状备用。 1.3 药剂的配置

将泡桐花提取物用无菌水溶解，配置成200.00 g·L-1的储备液。在无菌环境中，同时采用等比稀释法，用无菌水将待测液稀释成100.00 g·L-1、50.00 g·L-1、25.00 g·L-1、12.50 g·L-1和6.25 g·L-1备用。 1.4 抑菌效果的评价

(1)KB试纸法测试对细菌的抑制作用

滤纸片的制备：将直径为6 mm的滤纸圆片，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，烘干后置于10 g·L-1的提取液中浸泡8 h，在无菌风中吹干备用。以无菌水浸过的滤纸片做空白对照。

采用倒平板法，取200 μL供试细菌，与已熔化并冷却至50 ℃左右的LB固体培养基混合，摇匀，待培养基凝固后，制成含菌的平板。再通过无菌操作将含药液的滤纸片，对称贴放于上述琼脂平板上，正置培养30 min后，将培养皿倒置，于37 ℃恒温培养，8～12 h后观察并用十字交叉法测量抑菌圈直径。每个平皿放置一片含相同提取条件下空白提取液的滤纸片作阴性对照。

(2)菌丝生长速率法测试对真菌的抑制作用

取泡桐提取物1 mL于培养皿中，同时加入9 mL融化并冷却至50 ℃的PDA固体培养基，摇匀，待培养基凝固后，即为含药液的平板。用打孔器将长势相同的菌点接到上述平板上，正置培养30 min后，将培养皿倒置，于28 ℃恒温培养，48 h后观察并用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。每个试验重复3次。 抑菌率计算公式[7]： 抑菌率/%=×100 1.5 供试菌种的制备

(1)细菌的分离和纯培养：采用平板划线法，于37 ℃电热恒温培养箱活化24 h；用牙签挑取单菌落，接种到20 mL LB液体培养基中，于37 ℃摇床中以200 r·min-1过夜培养[8]；移出100 μL菌液，加入4900 μL LB液体培养基，220 r·min-1，37 ℃下继代培养50 min；在600 nm下测得菌液OD值达到0.2，备用。

(2)真菌的分离和纯培养：用接种环挑取部分菌落点接到PDA固体培养基平板上，于28 ℃生化培养箱中，培养48 h。

1.6 提取物对供试细菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度

最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)指抑菌剂抑制培养基中微生物生长的最低浓度。最低杀菌浓度(Minimal bactericidal concentration，MBC)指抑菌剂能使活菌生长减少99%以上的最小浓度。

分别吸取不同浓度提取液1 mL，对照为无菌水1 mL，与熔化的培养基9 mL混匀制成平板，使提取物浓度分别为20.00 g·L-1、10.00 g·L-1、5.00 g·L-1、2.50 g·L-1、1.25 g·L-1和0.63 g·L-1。吸取100 μL菌悬液于培养基中，摇匀，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，沙门氏菌于28 ℃恒温培养箱中培养。24 h后，取出观察，未长菌的平板中加入的提取液的最低浓度即为提取物对该菌的MIC值。

在MIC的基础上，继续培养24 h后，取出观察，以完全没有菌生长的最低浓度作为提取物对该菌的MBC值。各浓度提取液均设3个重复。 1.7 提取物对供试真菌的毒力回归方程

在毒理学中，(最小)致死量的平均值即EC50[9,10]。被广泛用于表示化学品毒性大小、杀虫剂毒力高低，是表示化学品毒性的指标。

以菌丝生长速率法为基础，将菌饼接种到浓度为20.00 g·L-1、10.00 g·L-1、5.00 g·L-1、2.50 g·L-1、1.25 g·L-1、0.63 g·L-1的培养基上，观察各指示菌的生长情况，计算其抑菌率，通过Excel软件分析，得出其毒力回归方程以及EC50。 2.1 泡桐花乙醇提取物抑菌谱的研究

本试验针对乙醇提取物研究了其抑菌谱。对于真菌，本研究采用菌丝生长速率法，对5种供试真菌进行了研究。将供试真菌分别接种到含无水乙醇提取物(10 g·L-1)的PDA培养基平板上，培养48 h后，观察并测定真菌菌落直径的大小，计算出其抑菌率，以此评价无水乙醇提取物对供试真菌的抑制效果，试验重复3次，平均值见表1。

对于细菌，本研究采用滤纸片扩散法，对4种供试细菌进行了研究。将供试细菌分别涂布到LB固体培养基平板上，并在平板中贴上经无水乙醇提取物(浓度100 g·L-1)浸泡并晾干的滤纸片，培养24 h后，观察并测定其抑菌圈的直径，以此评价无水乙醇提取物对供试细菌的抑制效果，试验重复3次，其平均值见表1。 由表1可知，泡桐花无水乙醇提取物对5种真菌均有抑制作用，除桔青霉之外，抑制率均大于50%，其中对黑曲霉的抑制效果最好，抑制率达66.3%，对桔青霉的抑制效果最差，抑制率只有32.6%；对于4种供试细菌，泡桐花无水乙醇提取物只对3种细菌有抑制作用，其中，对枯草芽孢杆菌的抑制效果最好，抑菌圈直径达27.0 mm，对大肠杆菌没有抑制效果。

综上所述，泡桐花乙醇提取物对供试菌种几乎都具有抑制效果，因此，具有广谱的

抑菌效果，由此可推断，泡桐花在食品防腐方面具有潜在的研究价值。 2.2 泡桐花乙醇提取物对供试真菌的毒力回归方程及EC50

采用菌丝生长速率法，对黑曲霉、米曲霉、黑根霉和绿色木霉4种真菌进行了其毒力回归试验。将供试菌种接种到含不同药液浓度梯度为(20.00 g·L-1、10.00 g·L-1、5.00 g·L-1、2.50 g·L-1和1.25 g·L-1)的PDA培养基平板上，培养48 h后观察，测定真菌菌落直径的大小，计算出抑菌率。试验重复3次，结果见表2。 由表2经单因素方差分析，得表3。

由表3可知，不同浓度的泡桐花无水乙醇提取物对黑曲霉、米曲霉、黑根霉和绿色木霉的抑制率具有显著的影响，P值均为0.0000。

泡桐花无水乙醇提取物对供试真菌的毒力回归方程和其EC50值见表4。 通过毒力回归方程可以计算得出：泡桐花乙醇提取物对黑曲霉、米曲霉、黑根霉和绿色木霉的EC50值分别为7.33 g·L-1、14.15 g·L-1、13.11 g·L-1和9.71 g·L-1，表明泡桐花提取物对黑曲霉的抑制作用最强。

2.3 泡桐花乙醇提取物对供试细菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC) 由试验结果(表5)可看出：泡桐花乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的MIC值分别为5.0 g·L-1、10.0 g·L-1和10.0 g·L-1，MBC值分别为10.0 g·L-1、20.0 g·L-1和20.0 g·L-1表明泡桐花提取物对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强。

本试验已经证明了泡桐花的生物活性成分有一定的抑菌作用，但未分离鉴定抑菌活性物质。通过试验虽然已得出泡桐花的生物活性物质对几种供试菌除大肠杆菌外都有一定的抑制作用的结论，但是本试验的研究范围还是比较窄，今后需要对泡桐花的抑菌普进行深入研究。本试验研究了泡桐花提取物的抑菌活性，泡桐花无水乙醇提取物抑菌性能试验结果表明，提取物对5种供试真菌和3种供试细菌都具有一定的抑制作用，在无水乙醇提取物为10 g·L-1的情况下，对黑曲霉、米曲霉、桔

青霉、黑根霉和绿色木霉的抑制率分别为66.3%、57.5%、32.6%、63.5%、和53.0%；对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌圈分别为27.0 mm、22.0 mm和10.0 mm。其中，对黑曲霉(EC50=7.33 g·L-1)和枯草芽孢杆菌(MIC=5.0 g·L-1)抑制效果最好。由此可知，泡桐花对食品防腐中常见的菌种具有较强的抑制活性，是一种质优价廉的材料，作为天然食品防腐剂具有很大的开发潜力。

【相关文献】

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