８８ ・实验研究・ 版社，２００４：４６７—４６８． Ｊｕｌｙ ２０１３，Ｖｏ１．１１，Ｎｏ．２０圆衄 神经细胞培养的影响［Ｊ］．实用医药杂志，２００２，１９（３）：５３—５６． ［４］李玉，但齐琴，习杨彦彬．成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定 ［Ｊ］．昆明医学院学报，２０１１，３２（６）：２９—３２． ［２］ 《中国组织工程研究与临床康复》杂志社学术部．组织工程研 究中神经细胞的培养［Ｊ］＿中国组织工程研究与临床康复，２０１１， １ ５（５０）：９４６６—９４６７． ［５］于样，金英ｌ｛申经细胞培养方法在缺血性脑损伤研究中的应用 ［Ｊ］＿锦州医学院学报，２００３，２４（１）：５３—５６． 【３】于丽华，赵书平，席先成，等．不同种类血清对新生大鼠大脑皮层 复方硫酸锌滴眼液无菌检查方法的建立 王瑛 杨利红 （黑龙江省食品药品检验检测所，黑龙江哈尔滨１５０００１） 【摘要】目的建立复方硫酸锌滴眼液的无菌检查方法。 方法按照《中国药典》２０１０年版附录的要求，采用薄膜过滤法，通过接种６株阳 结果６株阳性代表菌株在试验组与阳性对照组均生长良好。结论本法可消除复方 性代表茵进行方法学验证，冲洗液用量为每筒３００ｍＬ。 硫酸锌滴眼液的抑茵作用，适用于该制剂的无菌检查。 【关键词】复方硫酸锌滴眼液；无菌检查；方法学验证 中图分类号：Ｒ９ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１６７１－８１ ９４（２０１３）２０－００８８－０２ 复方硫酸锌滴眼液对革兰阳性菌及革兰阴性菌均具有抑制作用， 用于治疗结膜炎、沙眼等眼部感染，是临床常用药物。为有效控制药 备好的上述６株菌液，再加入相应的培养基ｌＯＯｍＬ，按规定条件培养 ３－５ｄ，逐日观察。 ２．２．２菌液组 品的质量，保证无菌检查方法的科学性和检验结果的准确性。根据 Ⅸ中国药典 ２０１０年版 附录无菌检查的要求，建立复方硫酸锌滴眼 液的无菌检查方法，并对其进行方法学验证。 １材料 另取６个滤筒，加入相应的等量培养基，分别加入１ｍＬ各试验菌 液，按规定条件培养３－５ｄ，逐日观察。 ２．２．３供试品对照组 １．１培养基与试剂 硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、蛋白胨、肉汤培养 基。以上均为北京三药生产。 １．２菌种 取供试品２０支，置２个滤筒中过滤（每筒１Ｏ支），冲洗液用量为 每筒３００ｍＬ，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各 １００ｍＬ，按规定条件培养３￣５ｄ，逐日观察。 ２．２．４阴性对照组 金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６ ００３】、大肠埃希氏菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４ ｌＯ２］、枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３ ５０１］、生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４ ９４１］、 白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８ ００１］、黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８ ００３］。 １．３样品 取试验用０．１％无菌蛋白胨水溶液３００ｍＬ，分置两个滤筒中过滤， 再分别加入硫乙醇酸盐培养基和改良马丁培养基，按规定条件培养 ３～５ｄ，逐日观察。 表１试验组与阳性对照组微生物生长情况 复方硫酸锌滴眼液（哈尔滨医科大学附属第一医院，批号： ２０１０１１２３，２０１０１１２４，２０１０１１２５规格：５ｍＬ／支）。 ２方法与结果 ２．１菌液制备 取经３０￣３５℃培养１８￣２４ｈ的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草 注： “＋”表示微生物生长良好， “ ”表示无微生物生长 芽孢杆菌营养肉汤培养物各ｌｍＬ、取经２３￣２８℃培养２４￣４８ｈ的白色念 珠菌的改良马丁液体培养物ｌｍＬ、３０￣３５℃培养１８－２４ｈ的生孢梭菌的 硫乙醇酸盐液体培养物ｌｍＬ，分别加入０．９％无菌氯化钠溶液９ｍＬ中１０ ３讨论 眼用药剂是指用于治疗和诊断眼疾直接用于眼的各类剂型。包括 滴眼剂、洗眼剂、眼膏剂、眼用注射剂以及眼用膜剂和接触眼镜等。 倍依次稀释至浓度约为１０－１００ｃｆｕ／ｍＬ，取经培养５￣７ｄ的黑曲霉改良马 丁琼脂斜面培养物，加入含０．０５％（ｍＬ／ｍＬ）聚山梨酯８Ｏ的０．９％无菌氯 化钠溶液５ｍＬ，将孢子洗下，摇匀，吸取 ｌｍＬ至无菌试管中，用含０．０５％（ｒｎＬ／ｍＬ）聚山梨酯８０的０．９％无菌氯 化钠溶液ｌＯ倍稀释至浓度约为１０－－－１００ｃｆｕ／ｍＬ，备用。 ２．２方法验证 ２．２．１试验组 虽然眼用药剂（除眼用注射剂外）均非直接进入组织或血液，但由于 眼组织较为娇嫩，一旦受损后果严重，因此眼用药剂不同于一般的外 用制剂，均要求无菌以保证用药安全。因此 中国药典》２０１０年版中 要求眼用制剂以无菌检查法取代微生物限度检查。 复方硫酸锌滴眼液主要成分为盐酸小檗碱、硫酸锌和硼酸，具有一 定的抗菌作用，可与细菌ＤＮＡ形成复合物，从而影Ｉ￣ＤＮＡ的复制，干 扰细菌生长繁殖；对革兰阳性菌及革兰阴性菌如痢疾杆菌、大肠杆菌、 伤寒杆菌、溶血ｌ生链球菌、肺炎链球菌、结核杆菌等都有抑制作用；并 能增强人体白细胞的吞噬功能。用于治疗结膜炎、沙眼等眼部感染。 本试验采用薄膜过滤法对样品的无菌检查进行方法学验证，以每 株菌接种１０支的样品量进行验证试验，冲洗量选取以每筒３００ｍＬｌ［Ｊ可 取供试品６Ｏ支，分别置６个滤筒过滤（每筒ｌ０支），冲洗液用量 为每筒３００ｍＬ，分次冲洗并在最后一次冲洗液中分别加入ｌｍＬ已制 ＋通讯作者 国眶｜团旧匝２０１ ３年７月第１ １卷第２Ｏ期 ・实验研究・８９ 蜈蚣胃蛋白酶解物体外抗凝活性肽类的分离与分析 陈保红 耿亚 马永明 （漯河医学高等专科学校第二附属医院，河南漯河４６２３００） 【摘要】目的采用凝胶过滤色谱和ｃ ８反相色谱对蜈蚣胃蛋白酶解物的抗凝活性部分进行分离和纯化，并检测其相对分子质量分布范围。 方法光谱法收集各凝胶色谱并分离各流分；用活化部位的凝血活酶时间（ＡＰＴＴ）作为指标，检测各流分体外的抗凝活性；用基质辅助激 光解吸电离飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ）检测其相对分子质量的分布范围。结果经过滤色谱和ｃ， 反相色谱纯化后得到了抗凝活性成 分，并测得成分中的相对分子质量的分布范围在５６８－１１２６之间。结论凝胶过滤色谱和ｃ 反相色谱对蜈蚣胃蛋白酶解物的抗凝活性部分 进行分离和纯化后，抗凝活性组分是小分子肽类。 【关键词】蜈蚣胃蛋白酶解物；凝胶过滤色谱；ｃ１８反相色谱；抗凝活性肽 中图分类号：Ｒ２８２ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１６７１－－８１９４（２０１３）２０－００８９－０１ 蜈蚣，民间又被称：勾天龙、千年虫，属节肢动物蜈蚣科，关于它 的记载最早的著作是《；｝申农本草经》，迄今已有２０００年的历史。一般 取蜈蚣干燥虫体入药，其本身亦有毒性，可以解毒散结、通经络止痛 蜈蚣胃蛋白酶酶解液中Ｆｌ，Ｆ２，Ｆ３为蛋白或多肽类成分，ＡＰＴＴ 药效显示Ｆ３具有抗凝活性，其中Ｆ３—３抗凝药效最好，经体￣ｂＡＰＴＴ分 析，ＬＦ１，ＬＦ２均为具有抗凝活性的组分，其中ＬＦ２—１，ＬＦ２．２活性最 等功效。在临床上多用于治疗ＪｂＪＩ，惊风、疮疡、肿毒、烫伤、风癣 等。除此之外，蜈蚣还有治疗心血管疾病的功用 ｌ。蜈蚣的提取物中 的有效成分如抗凝活性肽类物质在临床上有着同样重要的功效。如使 血管平滑肌舒张，改善冠脉供血口】。在动物实验研究中显示，蜈蚣提 取液对急性心肌缺血的大鼠再灌注损伤的左心功能有明显的保护作 用，而且存在一定的量：效关系 ］。可见，蜈蚣及其提取物对人类健康 有着很大的贡献，在临床应用中有着不可估量的作用，因此，本篇实 强，而ＬＦ３无抗凝活性。经过分离的成分经双缩脲反应均为蛋白或多 肽类成分。 ３讨论 本实验通过多种仪器来分离纯化提取蜈蚣胃蛋白酶解物体外抗凝 活性肽类，所得的小分子双缩脲反应均为肽类，故称之为小分子肽 类。虽然实验过程看似复杂，实则简单易操作，且重复性好，稳定性 高，实验设计严谨，可操作性强。该种方法分离小分子肽类值得推 广。对于动物性药物成分的提取技术，该类实验设计和方法亦为以后 的实验打下科学基础。动物性药物成分的提取对于学科发展、临床应 验将提取并分离的有效成分做研究，为学科发展和临床应用提高科学 的理论基础。 １资料与方法 １．１仪器准备 分光光度计、离心机、电子分析天平、恒温水浴锅、真空干燥箱、 血小板聚集凝血因子分析仪、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。 １，２材料准备 自制蜈蚣胃酶解物、牛血清白蛋白、ＡＰＴＴ试剂、乙醇、纯净 用有着跨时代的意义，大大节省了材料资源，提高了药效，减轻了患 者药物在人体内代谢的毒副作用。动物药中主要含有蛋白质、肽类以 及氨基酸等物质，通过科学的酶解作用，将大分子的蛋白水解为小分 子肽类，通过色谱一些列的分离技术，纯化，再提取，再分离，从而 最终获得分子量很小但却有着完整的抗凝活性的小分子肽类物质，在 学科发展上成为一大突破。这种技术的应用能够使分子量５０００的肽类 缩小成为１０００以下的小分子肽类。而蜈蚣胃酶解液在葡聚糖凝胶过滤 水、Ｃ 反相填料、不同规格色谱柱、健康的大白兔。 １．３方法 色谱ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一５０和Ｇ．２５柱分离后，通过经ＡＰＴＴ抗凝血药效试验筛 选，得到抗凝活性最强的流分Ｆ３．３，而后通过经Ｃ。。柱色谱法，依据洗 脱图谱合并流分，得到了４个组分，这４个组分中，抗凝活性最强的是 粉红色的ＬＦ２－１和ＬＦ２—１。 制备样品以及空白对照品，对照品即是生理盐水；在白兔耳缘静 脉注射戊巴比妥钠进行麻醉，后颈动脉取血，离心后取上层清液ｔ取 样品液分别加入ＡＰＴＴ试剂，测定ＡＰＴＴ值；对蜈蚣胃蛋白酶酶解液进 行色谱分离，按色带标记为Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３，Ｆ４。将具有抗凝活性的成分 继续进行色谱分离测定药效，记录色带Ｆ３—１，Ｆ３—２，Ｆ３—３，Ｆ３—４；Ｃ１８ 反向柱色谱分离药效成分，标记为ＬＦ１，ＬＦ２（ＬＦ２－ｌ，ＬＦ２－２），ＬＦ３ ｌ ＨＰＬＣ￣定抗凝活性成分纯度，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 测定成分相对分子量的范围；ＡＰＴＴ抗凝药效试验测定药效成分活性 最强物质。 参考文献 【１】王勇炫，吴伟康，吴以岭，等．蜈蚣有效部位抗心肌缺血的ＮＯ机制 研［Ｃ］．贵阳：全国中药学术研讨会论文集，２００９：３８６． 【２】司秋菊，王鑫国，王亚利，等．蜈蚣对动脉粥样硬化家兔血管内皮 细胞生长因子的影响［Ｊ］冲西医结合心脑血管病杂志，２０１０，１（１）：５． ［３］ 张明泉，王亚利，温瑞书，等．蜈蚣提取液对大鼠心脏血流动力学 的作用研究［Ｊ】．河北中医，２０１０，２６（９）：７１６． ２结果 消除其抑菌作用。同时考察冲洗液、培养基对试验的影响，以证明试 验结果的可靠性。本试验建立的无菌检查方法准确、可行，为临床用 药安全提供有力保障。 参考文献 【１】国家药典委员会．中国药典（二部）【Ｓ】．北京：化学工业出版社， ２０ｌ０：１Ｏ３．１Ｏ７．
