小卷蛾斯氏线虫β-微管蛋白基因的克隆与序列分析

第３６卷第７期　２００８年７月　东北林业大学学报　Ｖｏ１．３６　Ｎｏ．７　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＮＯＲＴＨＥＡＳＴ　ＦＯＲＥＳＴＲＹ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　Ｊｕ１．２００８　小卷蛾斯氏线虫ｌ３一微管蛋白基因的克隆与序列分析　’　秦松柏　（东北林业大学，哈尔滨，１５００４０）　樊　东　（东北农业大学）　李春杰　许艳丽　（中国科学院东北地理与农业生态研究所）　摘　要　用ＴＲＩＺＯＬ法提取了小卷蛾斯氏线虫ＲＮＡ，利用ＲＴ—ＰＣＲ和ｃＤＮＡ末端快速扩增技术（ＲＡＣＥ）技术　克隆了两条小卷蛾斯氏线虫１３一微管蛋白基因ｃＤＮＡ的３　端序列。将得到的ｃＤＮＡ序列提交到ＧｅｎＢａｎｋ，分别获　取登录号ＥＵ０４９８５７和ＥＵ０４９８５８。两个序列　长度分别为１　３７２碱基（ＳＣＴＵＢ１）和１　３７４碱基（ＳＣＴＵＢ２），分别编码　４３４和４３２个氨基酸，编码的蛋白的分子量在４８　ｋＤａ左右。氨基酸的１２４～１３１位存在一个微管蛋白信号片段　ＧＧＧＴＧＳＧ。序列分析表明，分离得到的两个基因与其他线虫的微管蛋白基因具有较高的同源性，核苷酸序列同源　性在６５％以上，氨基酸序列同源性在８１％以上，两个氨基酸序列都含有两个氨基酸保守区ＮＮＷＡＫＧＨＹ和ＲＫＡＦ—　ＬＨＷＹＴＧＥＧＭＤＥＭＥＦＴＥ　关键词　小卷蛾斯氏线虫（＆ｅ　ｍｅ，凇ｃａｒｐｏｃａｐｓａｅ）；１３一微管蛋白；克隆；序列分析　分类号Ｓ１５４．３８６　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｕｂｕｌｉｎ　ｅＤＮＡ　ｆｒｏｍ　Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａ　ｃａｒｐｏｃａｐｓａｅ／Ｑｉｎ　Ｓｏｎｇｂａｉ（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００４０，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）；Ｆａｎ　Ｄｏｎｇ（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｌｉ　Ｃｈｕｎｊｉｅ，Ｘｕ　Ｙａｎｌｉ（Ｎｏｒｔｈ—　ｅａｓｔ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇｅｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ＡＶｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）／／Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉ—　ｖｅｒｓｉｔｙ．一２００８，３６（７）．一７２—７４，８３　ｎｌｅ　Ｉ１０ｔａｌ　ＲＮＡ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｓｔｅｉｎｅｒ　ｍｎ　ｃａｒｐｏｃａｐｓａｅ．Ｔｗｏ　Ｂ—ｔｕｂｕｌｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｃａｒｐｏｃａｐｓａｅ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｂｙ　ＲＴ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）．Ｔｈｅ　ｔｗｏ　Ｂ—ｔｕｂｕ￣ｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ　ａｓ　ＳＣＴＵＢ１　ａｎｄ　ＳＣＴＵＢ２　ａｎｄ　ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ　ｔｏ　Ｇｅｎｂａｎｋ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ＥＵＯ４９８５７　ａｎｄ　ＥＵ０４９８５８．ＳＣＴＵＢ１　ａｎｄ　ＳＣＴＵＢ２　ｒｅ—　ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　１　３７２　ｂａｓｅ　ｐａｉｒｓ　ａｎｄ　１　３７４　ｂａｓｅ　ｐａｉｒｓ　ｗｉｔｈ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　４３４　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ａｎｄ　４３２　ｒｅｓ—　ｉｄｕｅｓ．Ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｔｗｏ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　４８　ｋＤａ．Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｔｕｂｕｌｉｎ　ｓｉｇｎａｔｕｒｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ＧＧＧＴＧＳＧ　ａｔ　１２４　１３１　ｓｉｔｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ．Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｎｄ　ｔａｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｂｏｔｈ　ｓｈａｒｅｄ　ｉｇｈ　ｉｈｄｅｎｔｉｔｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｒｏｍ　ｏｔｈｅｒ　ｎｅｍａｔｏｄｅｓ．Ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅ－　ｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｗｅｒｅ　６５％ａｎｄ　８１％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　ｌｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｓｈａｒｅｄ　ｔｗｏ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｍｏｔｉｆｓ　ＮＮＷＡＫＧ】｛Ｙ　ａｎｄ　ＲＫＡＨ　Ｈ　ＧＭＤＥＭＥＶＩＥ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｎｅｍａｔｄｅ　ｔｕｂｕｏｌｉｎｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａ　ｃａｒｐｏｃａｐｓａｅ；３－ｔｕｂｕｌｉｎ；Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　昆虫病原线虫是近几十年发展起来的一种极具潜能的生　物防治因子。因其具有杀虫范围广、对人和环境安全无毒、易　于基因操作改良、并能以低成本的人工培养基大量繁殖等特　点而越来越受到生防领域的重视ｌｌ　Ｊ。而微管是在所有真核　细胞中所普遍存在的结构，它由ｄ和Ｂ微管蛋白组成的二聚　体、少量的　微管蛋白及少量的微管结合蛋白组成，并呈酸　性。ｄ和Ｂ微管蛋白均由４５０左右个氨基酸组成，分Ｎ端区、　中间区和Ｃ端区。Ｎ端区有ＧＴＰ结合位点，Ｃ端区是抗微管　药物结合区，还可以与微管相关蛋白结合以调节微管装　配　－３　Ｊ。越来越多的报道表明，微管蛋白个别氨基酸的改变　可引起微管蛋白结构的变化，从而导致虫体对以微管为靶点　的药物抗性的产生　。其原因可能是个别氨基酸的改变导　致了微管蛋白上与相应药物的高亲和力位点的丧失，使抗微　管药物无法有效地与微管蛋白上的靶点相结合。为了更好地　从分子生物学角度研究微管蛋白在昆虫病原线虫生长发育过　程中所起的作用及其与抗微管药物间的作用机理，笔者以小　卷蛾线虫（Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａ　ｃａｒｐｏｅａｐｓａｅ）为材料，通过ＲＴ—ＰＣＲ和　ＲＡＣＥ技术扩增，得到了两个昆虫病原线虫Ｂ一微管蛋白基因　３　端序列，并对其序列进行了分析。　试验所使用的小卷蛾斯氏线虫由中国科学院东北地理与　农业生态研究所无公害农业学科植保组提供，并在中国科学　院东北地理与农业生态研究所作物生理生态实验室通过活体　培养获得大量侵染期线虫；ＲＮＡ提取试剂盒ＴＲＩｚｏｌ＠Ｒｅａｇｅｎｔ　为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品、反转录酶Ｍ—ＭＬＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎ—　ｓｃｒｉｐｔａｓｅ、克隆载体ｐＧＥＭ—Ｔ　ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ、低熔点琼脂糖购自　Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＤＮＡ胶回收试剂盒购自Ｔａｋａｒａ公司；Ｔａｑ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ聚合酶为上海生工生物工程公司产品，受体菌ＪＭｌｔＹ）由　中国科学院东北地理与农业生态研究所作物生理生态实验室　保存，其余试剂为进口或国产分析纯。　１．２小卷蛾线虫总ＲＮＡ的提取　Ｔｒｉｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）抽提小卷蛾线虫的总ＲＮＡ（按　试剂盒说明操作）。所用试验材料、器皿和试剂均经ＤＥＰＣ　（焦碳酸二乙酯）处理，以去除ＲＮａｓｅ。提取的小卷蛾虫总　ＲＮＡ放入冰箱中一８Ｏ℃保存备用。　１．３利用ＲＴ—ＰＣＲ和３　ＲＡＣＥ技术克隆基因的３　ｃＤＮＡ序列　将５　Ｌ总ＲＮＡ和１　ＩｘＬ反转录引物（ｄｔ—Ａｄａｐｔｅｒ—ｐｒｉｍ—　ｅｒ：５　ＧＡＣ　ＴＣＧ　ＡＧＴ　ＣＧＡ　ＣＡＴ　ＣＧＡ　ｍ　ｍ　ｍ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　１材料与方法　１．１线虫来源、菌株、质粒与试剂　１）中国科学院知识创新工程重要方向项目（ＫＺＣＸ２一Ｙｗ一　４０８）。　ＴＴＴ一３　）混匀于ＰＣＲ管中，于ＰＣＲ仪上７Ｏ℃放置５　ｍｉｎ，然　后立即冰浴２　ｍｉｎ。再向ＰＣＲ管中加入５　５　ｘ　ＲＴ缓冲液、　１２　ＩｘＬ　ｄＮＴＰ、１　ＩｘＬ　ＲＮａｓｉｎ和１　ＩｘＬ　Ｍ—ＭＬＶ反转录酶，将上述　混合物于ＰＣＲ仪中完成逆转录过程：４２℃保温６０　ｍｉｎ，９５℃　灭活５　ｍｉｎ，４℃保持。　根据已知线虫犬心丝虫（Ｄｉｒｏｉｆｌａｒｉａ　ｉｍｍｉｔｉｓ）、栉状古柏线　虫（Ｃｏｏｐｅｄａ　ｐｅｃｔｉｎａｔａ）、盘尾丝虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ　ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、马来　丝虫（Ｂｒｕｇｉａ　ｍａｌａｙｉ）微管蛋白基因的保守区的核苷酸序列，　设计了上游弓ｌ物：Ｔｕｂ　５　一ＧＣＴ　ＧＣＣ　ＡＡＧ１＿ｒＣ　ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＧＴ一　３　；根据反转录引物设计了下游引物：Ａｄａｐｔｅｒ—ｐｒｉｍｅｒ：５　一　ＧＡＣ　ＴＣＧ　ＡＧＴ　ＣＧＡ　ＣＡＴ　ＣＧＡ一３　，引物由上海生工生物工　第一作者简介：秦松柏，男，１９８１年１Ｏ月生，东北林业大学生命　科学学院，硕士研究生。　通讯作者：许艳丽，中科院东北地理与农业生态研究所，研究员。　收稿日期：２００７年９月１９日。　责任编辑：张建华。　维普资讯 http://www.cqvip.com 第７期　秦松柏等：小卷蛾斯氏线虫１３一微管蛋白基因的克隆与序列分析　７３　程技术服务有限公司合成。ＰＣＲ扩增按如下程序进行：９４　ｏｃ，　１　ｍｉｉｆ：５５　ｃＣ，１　ｍｉｎ；７２　ｏｃ，２　ｍｉｎ；３０个循环后，７２　ｃＣ，１０　ｍｉｎ；４　ｃＣ保持。ＰＣＲ产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳检测。ＰＣＲ产物　回收，与ｐＧＥＭ—Ｔ　ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒ连接，转化Ｅ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９，菌落　在含有ｘ—ｇａｌ和ＩＰＴＧ的平板上进行蓝白斑筛选，对于白斑，　按文献［６］进行酶切和ＰＣＲ鉴定。鉴定结果由上海生工生　物工程公司进行序列测定。　１．４序列分析　’　利用ＥｘＰＡＳｙ网站（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｄｎａ．ｈｔｍ１）　的蛋白分析软件对获得的ｃＤＮＡ序列进行翻译，翻译得到的蛋　白质等电点及结构域预测，也可以通过ＥｘＰＡＳｙ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘ—　ｐａｓｙ，ｏｒ＃）的相关蛋白分析工具获得。利用ＣｌｕｓｔａｌＷ软件进行　多序列比较及同源性百分数计算。序列比对的线虫来自于　ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）中与克隆基因氨基　酸序列同源性较高的线虫，这些线虫分别是蛇形毛圆线虫　（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｆｉｏｒｍ￣）、粪类圆线虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｅｒｅｏ—　ｒａｌｉｓ）、犬心丝虫（Ｄｉｒｏｉｌｆａｒｉａ　ｉｍｍｉｔｉｓ）、栉状古柏线虫（Ｃｏｏｐｅｒｉａ　ｐｅｃ一　誊　氲　ｔｉｎａｔａ）、盘尾丝虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ　ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、马来丝虫（Ｂ，－￣ｇｉａ　ｍａｌ－　）、碗形盅口线虫（Ｃｙａｔｈｏｓｔｏｍｕｍ　ｃａｔｉｎａｔｕｍ）、辐射杯环线虫（　Ｃｙｌｉｃｏｃｙｃｌｕｓ　ｒａｄｉａｔｕｓ）、十二指肠钩虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ｄｕｏｄｅｎｄｅ）。　２结果与分析　２．１小卷蛾线虫１３一微管蛋白序列的获得　ＰＣＲ产物经１％的琼脂糖凝胶检查发现，扩增出的条带大　小约为１　４００　ｂｐ，与期望的片段大小相符，并且具有良好的重复　性和特异性。ＰＣＲ产物经纯化后克隆到ｐＧＥＭ—Ｔ载体中，选　取５个阳性克隆测序，得到２个分别为１　３７２　ｂｐ和１　３７４　ｂｐ的　片段，在ＧｅｎＢａｎｋ上用Ｂｌａｓｔ软件搜索，找到同源性较高的序列　均为线虫Ｂ一微管蛋白ｃＤＮＡ序列，初步断定这段ｃＤＮＡ序列属　于线虫１３一微管蛋白全长ｃＤＮＡ序列的一部分，经推导，它们编　码的蛋白分别含有４３４和４３２个氨基酸，分子量分别为４８　４４３　Ｄａ　和４８４８６Ｄａ（图１和图２），克隆得到的两条ｐ一微管蛋白ｃＤＮＡ　序列已经登录ＧｅｎＢａｎｋ，并获得登录号，分别为：ＳＣＴＵＢ１，Ｇｅｎ—　Ｂａｎｋ登录号为ＥＵ０４９８５７；ＳＣＴＵＢ２，ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＥＵ０４９８５８。　鼍　霉　镰　罨　豁　墓　嚣　嚣　氛霉甏　露　藩　裁　蔑鼗　嚣　谨　霪　繁　鼗　薯鼍　警　髂　撩　嚣　爹　舔　嚣　嚣　玺　聱　ｌ　霪　嚣羹　妻囊鼍　霹妻　囊霉耋　嚣差　毒镬差　嚣墓　蔑　舔镰毽舔　蕊　奄遵　棼馨蔫　瓷　鼍懿　镰莨　．　惫　．　舔　嚣　嚣鼍氟毽　§奄豁　宅　藏　露　嚣　嚣　豁　嚣　妻　塞　熬　蘩　蘩　鬻　警　霪　建　罄　露　藩嚣嚣巍巍落警巍嚣嚣嚣罄豢露繇嚣茹嚣臻餮Ａ嚣繁藩露誉露谣嚣嚣嚣轰警嚣警繁臻　繇嚣嚣　奄漆漆蠡嚣露蕊罄嚣０燕霞謦嚣蟊纛霪豢　瑶　筵　雾　魏　．庭　繁　錾　静　器　萋　擎　眷　各寡　嚣　嚣　巷嚣繁嚣嚣嚣嚣嚣鬻蕊嚣嚣霉警荣瑶露褰黪纛袅嚣謦漆誊善霉嚣露豢嚣嚣露赣巍　纛蕊霞誊警霉嚣謦　警　豢《嚣　霉熹落　露嚣嚣薅袅　羲　嚣　霞　嚣　纂　露　嚣　雾　燕　黪　瓣　摹　雾　舔　霪　嚣　髂嚣霞露露袅蕊纛霪蕊袁苍警藩露漆嚣菇蕊藏器铬臻袅露建嚣：凫　蘧嚣嚣赣蘧巍貉嚣嚣嚣嚣　嚣蔑爨嚣ＴＣＧＴ￣袁鑫纛蕊嚣嚣霉嚣　建　嚣　嚣　甏蔫　馨　舔　舔　篷　矗　。盎　。蕾　Ｘ．　鬻　羹　嚣　巍　蓑　蘩　嚣　蘩　嚣　冀簦耋　羹露羹　器善§　擎嵇　藏警漆警嚣露謦嚣嚣蠡嚣纛纛露痞鑫建嚣嚣禽瑶撩应嚣嚣蠡墨露蜜臻袅　嚣嚣嚣繁嚣　袅　露霪囊　墨露嚣覆露荽警嚣藏露　嚣　馨　羹　漫　麓　器　嚣　嚣　豢旗　蔑薅《　罨　舔镰洛　Ｌ　谨　露　雾　鼋　赣　玺　豢　黎　繇　毽　镶　蕊蘩霞镰鼍　霪霪萋　毒鎏蠢　差罐摹　碡霉耋　嚣　霪　霜翻焉翟曩墨嚣霜睡　黑匿　黑露蚕—　嚣　薹　嚣　鞣　羞　嚣　羹《霪　羹毒誊　妻蓑蠢　箍§蠢　壹营萋　巷纂薹　霪霪耋　掌要誊　羹罐董　露量　巷萋　冀碡蠢　釜蠢蠢　誊露羹　妻蚤　露蓬藿　誊囊蠢　漆嚣袅　森露繁瀛警　嚣嚣漆蕊嚣窭嚣嚣袅鬻露纛琴嚣警　嚣蕾嚣镶鬻霉豢蓍嚣鬻琪霪豢露誊霉嚣誊嚣嚣　豢誊《嚣纛蕊露器爹霉誊霉嚣　蠹　繁　擎　嚣　戳　ｌ　霪　霪　雾　霪　器　霪　萝　嚣　镶磊嚣蕊嚣鬻嚣擎　露嚣露露纛巍嚣　嚣嚣纛嚣蕊褒嚣谣嚣　满嚣暴　霉霉謦嚣　霉嚣嚣蕊嚣嚣遴蕊　嚣露嚣嚣嚣嵇遘臻巍巍嚣漶嚣　警　罄　蓑　雾　繁　巍　嚣　熬　露　嚣　擎　襄　霉　惫　赣蔑嚣蔑　甏　镰驾　卷　蔑　魏豢舔　蔑　蕊　鏊。Ｔ霞　鼍　§　蒜　旗　甏。　氟　棼　蔑　蕊　黪　蠢　翟　萋　ｌ　嚣　蓑　莲　蠡　嚣　薹　霪　雾　嚣　鬻　鞋　鏊　毽　餐蔑Ａ毪蕊　甏　蔑馨《　蕊　强强　蔑￣７ＴＧ蔑裁甏罨　懑鼗鼍　旗ＴｉＴＣＴ　毫ＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＡＧＴＣ：　氮　萼　繁　嚣　豢　器　鬻　鬈　帮　囊　謦　嚣　蠢　露　蕊露露蘧霞嚣繁镬嚣嚣霉　嚣落嚣霉繁嚣　嚣霉露嚣鬻嚣磊嚣霉繁霪蕊　嚣嚣嚣蠢Ａ￣ＣＴＴＣ臻壤蕊藏嚣繁誊嚣嚣露≤嚣誉嚣纛壤嚣　謦　繁　嚣　蓼　雾　港　臻　嚣　袅　嚣　纛　黧　鏊　纛　攀　篝　纛繁　攥嚣嚣嚣签嚣警謦嚣露嚣　臻翟嚣蓄嚣霪巍爨謦鬻霞謦警爨　謦藩露　豢嚣落翟繁繁露臻嚣謦嚣露嚣　嚣嚣纛　磐鑫嚣嚣　露嚣　螽≤　雾　巍　鼗　蓼　器　挚　嚣　爹　馥　挚　蘩　巍　巍　嚣露纛嚣嚣嚣嚣嚣　臻露毒誊覆　嚣嚣豢露嚣嚣鬈鬻嚣袅嚣嚣嵇警嚣露嚣嚣嚣藤建嚣警霉蕊霉饕嚣糍髂嚣纛臻纛　嚣謦譬霉臻巍露臻嚣嚣　霸　鑫　藏　菇　羲　鼹　巍　羹　露　髓　雾　器　纛　蔑　镰　蔑　瀑　整藩爨霉毽　霉赣蔑≮镰　《赣　瑟　嚣　藩　舔玺　ＣＣＴＣ　嚣毪　毪毽　懿　甏蘸　鼗　Ａ　巍　嚣　器　鏊　嚣　嚣　爨　警　纛Ｔ　袅　藏　ＴＴＣ＇ＣＧＣＧＧＡＣ，￣Ｃ：ＡＴＧＴＣＣＡＴＧＣＧＣＧＡ￣ＧＴＣＧＡＣ　萋　黧　赣　鞣　嚣　嚣　馨　器　ＡＡＣ　罄　藩　鼍蔑蘸　毫　《　氧　镲铬　嚣　嚣　孽　譬　謦　馨　留　甏　豢　罨　惫　嚣　氟惫§　豁　爹　菱　嚣　莪　嚣　奄蕊　鬈　氧　ＧＣＧ．Ｃ　ＡＴＣＴＣＣＧＡ藩　棼　氇　瀑　瑟　赣　毪霉舔　。　毽　麓　霪　笔　露　蔑ＣＡ．ＡＧ　黪　麓　遗　嚣　ｌ　毽　宅　龟　ＡＡ．￣ＡＡＣＧＴＣ　Ａ　毽懿舔慧笔　｛　簿　鬻　繁　藏　警　菇　惫　鼍　棼素蕊　棼　耄露嚣　薹罐蠢　鼍蔑毽旗　巷　毯　旗赣蔑　羹零霉耋　冀卷耋　妻耄警妻　妻蠢塞　量霪嚣霪　连蚤差　霪　速　警　雾　§　露　辩　霪　譬　遘　露　蓑　鼍。　蔑　甏　舔鼍　鏊鏊　甏　甏　鬣　Ｇ￣ＣＴＴＣＣＴ　罄毂Ｃ－　蓼　嚣　黧　霎　孽　奄　嚣　嚣　矗　麓　嚣　藏　漫　蓑　霪　麓　甏毽　舔漆赣　薅　赣　甏　露诺　蕊嚣纛　警嚣§　嚣逮露漆舀嚣簌繁嚣露纛棼臻蕊露纛誉§翁建§鬻警　爨嚣蒜露蕊嚣　《　嚣纛荣誉嚣《壤纛嚣纛鬻薅蕊　Ａ嚣　蔑　蛰舔　整　娶藩蔑　舔　器　甏　蔑　鬈奄瓠　毽　蘸舔　鏊　舔　嚣　擎　鬈　嚣　警　键　臻　舔羲　蔑螽　甏蔑　舔　痞　篆　萋　遘　嚣　雾　蹙　嚣　漶　鹫　袅　慧　嚣　蠹　嚣　嚣　蓼　蔑　羲蕊毽　键　赣　琴　霪　差　繁　露　§　鼍　甏蠢舔　囊　麓　孽　纛　墓嚣蘸耋　罐誊量　薹嚣羹薹　零巍嚣纛赢蕊譬鬻譬巍馨漆鬻警蔑蕊嚣纛纛蠡　舔誊警霉蛰　巍霉鼍警袅藏巍纛巍纛巍纛磊蕊巍袭意鼎蕊轰巍藏建藏遴　图１　小卷蛾线虫ＳＣＴＵＢ１　ｃＤＮＡ片段及其编码的氢基酸序列　注：保守序列ＮＮＷＡＫＧＨＹ和ＲＫＡＦＬＨｗＹＴＧＥＧＭＤＥＭＥＦ丁Ｅ用双下划线表示、ＧＴＰ核苷酸结合位点（ＧＧＧＴＧＳＧ）涂黑表示。　维普资讯 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７４　＃誊　嚣鼋　誊￥聋｛女篓孽　蒋　羞蕈　蜃　东羹　＃《《　萋　瘩霉带霈　黪巷　孽　攀Ｉ譬　ｌ嘲舻巷　蛐　雾北林业大学学　报　雾　＃■耋《　摧　蠢雾蠢谚藿　弗耋　第３６卷　醛　娃滩豁髓　戢瓢　瓤瓢　嚣¨鞋　鞋　瓣　瓢瓣虬潍　弘　”　露嵇警舔卷喾轰蓬瑶警嚣　霉臻器落遘巍露澄警鼎霪蔑霉　嚣妫蕊　臻纛覆霞遘瑶嚣嚣黛　繁嚣豢纛露杂窭臻嵇　落罐建霪嚣鬻繁燕嚣　露　纛　装　磐　墓　ｌ　蘩　豁　蠢　簇　嚣　赣　雾　嚣　龆　霪　嶷骧落嚣镬尊漶　譬嚣蕊嚣巍鬻　鬻瞽霉蕊嚣露鬻臻番浸巍篓嚣磐纛鬻鬻嚣蔑　蘧霉嚣张嚣羲慕　舞ＡＣＧ￣ＧＣ露纛遘露露嚣嚣　臻　繁　嚣　豁　囊　器　繁　麓　蔫　遴　嚣　纛纛嚣嚣　露蘧　若露繁嚣爨豢　嚣嚣露嚣嚣嚣蓄貉嚣嚣嚣嚣萋露嚣满ＣＣ警器§纛嚣豢霞警嚣薅纛磊　蒜纛霪嚣露纛嚣霪　纛嚣霉鹰　熬　雾　藏　纛　警　蠢　豢　蒸　臻　勰　嚣　鹫　袅露嚣嚣霞袅嚣羹袅　嚣馘嚣露露豢荣臻嚣　嚣臻墨嚣嚣霉藏嚣謦嚣蠡舀覆嚣纛巍嚣繁蕊嚣臻繁镑嚣嚣　嚣魏嚣嚣　稿蔗杂誊嚣豢纛　麓　藏　嚣　嚣　鬻　漆　黧　镰蔑　羲　蕊镰　甏　蔑　舔　馨　萋　爹　罄　黧　鬻　甏蔑奄舔　蔑　鬈　甏　雾　器　奄　嚣　漆　薅　鏊　谯ｌ　蔑镰　赣　羹懿蔑　瓷　蔑鞋奄　建　嚣　　。，　，毒　舔　。鬣　蕊　．　鬻　嚣　嚣　巍　羹　嚣　擎　嚣　鬻　繇　器　鼋　蓄　豢嚣嚣　逸繇　舔　拳　鲁蕊整懿　毽　赣辍　舔　赣蕺　舔氯嚣　嚣　警　黧　骧　篆　巍　墓　豁　嚣覆嚣蓼嚣睡蕊嚣鬻器露纛嚣谣蕊嚣器鼹纛嚣繁藩露蘩嚣霞嚣臻　嚣解臻露赣．燕薅嚣嚣嚣繁嚣嚣繁嚣藏霪繁誊露藏戴蕊霰　嚣　墓　ｌ　赣蘸　篆　嚣　■—曩—●　——霸—●隧—●圈——露　豁　蓼　善　蠢　巍　ｌ　熬　罄　赣　露罨臻　喜菠整　豢莲　善　鼗舔　鬻　擎　器　藏　ｌ　露　鬣　豢　蓬　赣　奄奄蕊　毫　鼗　氧　镰舔　器　嚣　器　器　爹　嚣　嚣　簸　鼙　嚣菇露赣鬻霞露警嚣蠡繁警嚣蕊燕嚣嚣露誊纛霞蕊纛　嚣　备蕊嚣露鬻翟　鬻《嚣露霉嚣嚣蕊嚣嚣巍　霉鬻嚣露警鬻嚣囊蓥蕊巍嚣巍嚣巷　鼙　繁　慧　冀　纛　霉　嚣　滩　露　蠢　冀　麓　警　露巍嚣撂纛露巍　臻繁譬嚣嚣露露磊霪嚣嚣溶嚣巍袅　露Ａ．Ａ嚣豢霉嚣謦嚣警蕊棼赣纛露　鬻謦漆器鹫鬻嚣　嚣霉纛嚣嚣露謦嚣藏巍瀛　嚣　嚣　嚣　雾　嚣　嚣　蕊　蠢　警　罾　毒　藏　謦　鞋　嚣霪藩纛荣嚣嚣袭薅露豢嚣蕊巍　譬蕊霉纛露嚣嵇黛霪　嚣嚣褒纛露嚣ＡＡＣ鬻嚣嚣嚣嚣警露　龆　蠡嚣　蕊　壤漶嚣霉豢惑纛霪鐾§　謦　臻　繁　嚣　豢　辫　嚣　辩　警　鞘　薷　嚣　纛霉　巍嚣嚣鬻露鬻霪鼍警篓　巍茗繁露《露露嚣露磊嚣巍髓嚣鬻照滚巍嚣臻嚣鬻嚣　嚣　霉誊薅嚣蠹箍赢嚣　嚣　嚣蓍落　棼纛纛露　謦　警　嚣　蠢　虢　嚣　秸　爨　熬　Ａ　裔　虢　纛　繁　纛　镰　雾嚣嚣霞　棼嚣　瑶嚣漆嚣露鬻嚣豢纛　謦謦　霉嚣豢　嚣　嚣巷嚣嚣嚣　蘧嚣露霞ＴＣ￣Ｃ＇ＧＣＴＧ　嚣露嚣嚣菇纛袅露　枭誊　擎　爹　雾　鬻　嚣　嚣　蓼　爹　繁　譬　落　纛　擎　纛　霪　轰　麓　嚣器蕊蕊嚣嚣嚣蕊薅嚣纛嚣謦遴嚣　龉蠡落嚣嚣臻嚣藩蘩嚣嚣嚣Ｔ誊嚣嚣蘩器藏燕豢嚣蠢蕊霉　露轰臻露纛漆　霞鬻繁嚣臻　嚣露　蒜　繁　蘩　蕊　蕊　嚣　帮　蕊　蘩　氩　繁　臻　舒　艇　嚣　蠢　巍　蔑　繇　鼗　繇　蠢　。嚣　蘸器　鏊　敞　鏊　镰　．毳　孽蕊　舔　憋　鏊舔　舔鏊　裴　嚣　辩　謦　纛　露　嚣　挚　熬　嚣　羲　絮　纛　馨　巍　藏　越　警嚣　嚣落　嚣舔ＣＡＡ巷蕊霪臻謦　建鬻臻嚣嚣霞臻遘嚣露警嚣露蕊蘩臻巍嚣露纛缮螯警　嚣嚣器霉　嚣喾豢嚣巍　纛纛　菇纛嚣　黧　臻　嚣　毓　霪　羲　器　藿　蠢　嚣　謦　蚤　蕊　鼙　絮螽蕊瓮　馨蕊　豁蔑　舔　蕊憝　毪　遴　惫　蔑　菠蘧鏊　蔫惫　舔　穗　鼍　鬻　嚣　嚣　雾　篓　锷　爹　嚣　辩　簇　警　霪　鼙　嚣　罄　《苗露　矗《露霉嚣露￣ＴＣＣＣ蕊嚣臻交凛　露露臻建　臻繁鬻嚣臻警鬻舔髓　涛纛露警枣睡纛嚣霪豢嚣嚣漶　豢　袅　露纛轰　擎　嚣　舔　擎　懿　鍪　纛　嚣　嚣　嚣　繁　熹　露　蓑　嚣棠謦警繁露蕊蕊痞豢寄嚣嚣霉　鬻　磊器蒜嚣嚣纛嚣誊繁嚣燕嚣蓄露嚣豢纛蓥露罄嚣露露薅嚣露露　魏巍露落露警嚣警　ＣＴＴＣ．￣Ｃ　嚣　甏　曩　罨稳懿　玺毽　鼍　簇　蓑　奄　嚣　袅　蓼　瓣　毽　甏繇蛰　蕊鼗　甏　瞧繇　，魏蕊　巍　馨　霉　麓　露离嚣露譬霪湾蓼嚣蕊　霞露纛露鬻蔑嚣窭纛　嚣纛辔鬻藏　建器露赢鑫霪嚣嚣渡嚣露嚣嚣繁漆蔑巍臻蕊棼巍警露嚣嚣　菇藏露　氧蕊黎　搬镰毽蔑蕊豢蔑　黼毽　ＡＡＴ戆羲　嚣　鼍　霪　麓　謦　键　譬　篝　巍　霉　蔑攀　繇　嚣　蓉　甏繇　霪　豪　瓣　黪　羹　警　赣　餐　繁　罄毽蔑　蔑繇　　，舔　．蔑漆　惫　蔑　繇　蔑豁　－嚣馨　蕊　．蔑《　警　娥嚣蔑豁　罄　蒜　篡　嚣　嚣　繁　嚣　婺　蔑　舔　§蕊憩　《警　镰　繇螽　蔫蕊毽　　，蔑　图２小卷蛾线虫ＳＣＴＵＢ２　ｃＤＮＡ片段及其编码的氨基酸序列　注：保守序列ＮＮＷＡＫＧＨＹ和ＲＫＡＦＬＨＷＹＴＧＥＧＭＤＥ．ＭＥＦｒＥ用双下划线表示、ＧＴＰ核苷酸结合位点（ＧＧＧＴＧＳＧ）涂黑表示。　２．２微管蛋白的序列特性和同源性比对　利用ＥｘＰＡＳｙ网站（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｄｎａ．ｈｔ一　Ⅱ１１）的蛋白分析软件ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ对获得的基因推导的氨基酸　序列进行分析，结果发现：在ＳＣＴＵＢ１和ＳＣＴＵＢ２所编码的两　个氨基酸序列的１２４～１３０位存在一个微管蛋白信号片段　ＧＧＧＴＧＳＧ，是ＧＴＰ核苷酸结合位点，此位点在　一及Ｂ一微　管蛋白的聚合中起重要作用　］。　一和ｐ一微管蛋白都含有　两个微管蛋白的特征保守区ＮＮＷＡＫＧＨＹ和ＲＫＡＦＬＨＷＹＴ－　ＧＥＧＭＤＥＭＥＦＴＥ（图１和图２中已用双下戈０线标明）。　酸序列的同源性在６５．４％～７７．３％之间（表１）。　氨基酸序列的同源性序列比较分析表明，克隆的两个小　卷蛾线虫Ｂ一微管蛋白氨基酸序列间的同源性为８５．９％，与　以上几种线虫的Ｂ一微管蛋白基因氨基酸序列的同源性在　８１．５％～９４：２％之间。　３结论与讨论　两条小卷蛾斯氏线虫体内编码ｐ一微管蛋白的基因片段　为ＳＣＴＵＢ１和ＳＣＴＵＢ２。测序结果显示，ＳＣＴＵＢ１和ＳＣＴＵＢ２　同源性比较分析表明，克隆的两种小卷蛾线虫Ｂ一微管蛋　白基因核苷酸序列同源性７８．１％，与其它寄生他线虫蛇形毛　圆线虫（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）、粪类圆线虫（Ｓｔｒｏｎｇｙ－　ｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、犬心丝虫（Ｄｉｒｏｉｌｆａｒｉａ　ｉｍｍｉｔｉｓ）、栉状古柏线虫　（Ｃｏｏｐｅｒｉａｐｅｃｔｉｎａｔａ）、盘尾丝虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ　ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、马来丝虫　（Ｂｒｕｇｉａ啪２　）、碗形盅口线虫（Ｃｙａｔｈｏｓｔｏｍｕｍ　ｃａｔｉｎａｔｕｍ）、辐　射杯环线虫（Ｃｙｌｉｃｏｃｙｃｌｕｓ　ｒａｄｉａｔｕｓ）、十二指肠钩虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）等在Ｇｅｎｂａｎｋ登录的线虫的ｐ一微管蛋白基因核苷　的长度分别为１　３７２　ｂｐ和１　３７４　ｂｐ。经氨基酸序列推导，ｓｃ—　ＴＵＢ１和ＳＣＴＵＢ２分别编码４３４和４３２个氨基酸，分子量分别　为４８　４４３　Ｄａ和４８　４８６　Ｄａｏ在ＳＣＴＵＢ１和ＳＣＴＵＢ２所编码的　两个氨基酸序列的１２４～１３０位均存在一个微管蛋白信号片　段ＧＧＧＴＧＳＧ，是ＧＴＰ核苷酸结合位点，此位点在　一及Ｂ一　微管蛋白的聚合过程中起重要作用。目前，已有多种寄生线　虫的　一ｐ一及　一微管蛋白基因被克隆，但作为一种对人类　防治害虫有益的生物因子，在斯氏线虫属还是首（下转８３页）　维普资讯 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第７期　郑淼等：东北林蛙皮中胶原蛋白含量的测定及提取工艺　８３　ｍ＃Ｌ，０．４７０；１０．０００　ｍ＃Ｌ，０．９１６；１５．００Ｏ　ｍ＃Ｌ，１．２８８；得到　参考文献　标准曲线Ｙ＝０．０８２４　＋０．０６６　１，Ｒ　＝０．９９８　９，胶原蛋白消解　产物的吸光度为０．６０１，因此，羟脯氨酸质量浓度为６．４９２　ｍ＃Ｌ，经过换算得到胶原蛋白产品的纯度为５４．１％　，成品的　收率为１５％。　３结论　由于胶原是不溶于水的超高分子量物质，若想将它从林　蛙皮肤组织中提取出来有很多困难。采用酸酶结合提取，破　坏一部分肽键，使得胶原变成可以被醋酸溶解的可溶性胶原　蛋白，从而达到提取的目的。　利用废弃林蛙皮肤进行胶原蛋白的提取，测定出林蛙皮　［１］孟佳帆，王霞红，戎志毅，等．人源可溶性胶原的研制［Ｊ］．中国　生物制品学杂志，２０００，１３（３）：１６１—１６２．　［２］赵苍碧，黄玉东，李艳辉．从牛腱中提取胶原蛋白的研究［Ｊ］．哈　尔滨工业大学学报，２００４，３６（４）：５１５—５１９．　［３］林海，但卫华，曾睿，等．胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白的工艺优　化与过程模拟［Ｊ］．中国皮革，２００６，３５（５）：１９—２２：　［４］　ｕ　Ｈ，Ｌｉｕ　Ｂ　Ｌ，Ｇａｏ　Ｌ　Ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｂｕｌｌｆｒｏｇ　ｓｋｉｎ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，８４：６５—６９．　［５］Ｔａｋｅｓｈｉ　Ｎａｇａｉ，Ｎｏｂｕｔａｋａ　Ｓｕｚｕｋｉ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｆｒｏｍ　ｆｉｓｈ　ｗａｓｔｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ—ｓｋｉｎ，ｂｏｎｅ　ａｎｄ　ｆｉｎｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，　６８：２７７—２８１．　肤中总胶原蛋白的质量分数为２６％，通过对提取方法的优　化，得到最佳提取条件为３７　、７２　ｈ、３０　ｍｇ胃蛋白酶；以最佳　条件提取胶原蛋白，并经盐析、透析和真空冷冻干燥，得到海　绵状的胶原蛋白产品，含量检测表明，成品的收率为１５％，纯　度为５４．１％。　［６］李贺，郑庚修，王秋芬，等．生物医学材料胶原蛋白的研究进展　（Ｉ）［Ｊ］．中国皮革，２００５，３４（１１）：２４—２７．　［７］　付强，李国英，许燕．天然胶原高提取率的皮预处理方法的研究　［Ｊ］．中国皮革，２００６，３５（１）：２８—３５．　［８］　张俊杰，曾庆孝．比色法测定鱼鳞中羟脯氨酸的研究［Ｊ］．食品　科技，２００４（４）：８３—８５．　［９］　殷明文，南宇梅，王新民．分光光度法测定羟脯氨酸的改进［Ｊ］．　河南医科大学学报，１９９４，２９（１）：７４—７６．　［１Ｏ］施辉阳．酶法提取生猪皮胶原的研究［Ｄ］．北京：北京化工大　学化学工程学院，２００４．　［１１］　何少华，文竹青，娄涛．试验设计与数据处理［Ｍ］．长沙：国防　科技大学出版社，２００２．　［１２］　汪家政，范明．蛋白质技术手册［Ｍ］．北京：科学出版社，２０００：　６５—７２．　从得到的胶原产品看，纯度不是很高，有进一步纯化和精　制的空间。建议下一步工作放在对胶原蛋白的纯化上，从而　得到高纯度的胶原蛋白。　（上接７４页）次。克隆的两个小卷蛾斯氏线虫Ｂ一微管蛋白　克隆的两个小卷蛾斯氏线虫Ｂ一微管蛋白基因又有着明显的　区别，尤其在氨基酸序列的碳末端的氨基酸组成上有明显的　不同。作为多基因家族中的成员，它们在线虫不同发育时期　及不同组织器官所发挥的作用还有待于进一步研究。　％　基因在氨基酸水平和其它的寄生线虫都具有很高的同源性，　达８１．５％以上，并且都含有两段微管蛋白氨基酸序列特异的　保守区ＮＮＷＡＫＧＨＹ和ＲＫＡＦＬＨＷＹＴＧＥＧＭＤＥＭＥＦＴＥ。同时　表１线虫Ｂ一微管蛋白基因氨基酸（上三角）和核苷酸（下三角）序列的同源性　注：女表示由本研究克隆的线虫ｐ一微管蛋白基因。Ｔｃｔｕｂ：蛇形毛圆线虫（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ），Ｇｅｎｂａｎｋ登录号ＡＡＡ３０１００；Ｓｓｔｕｂ：　粪类圆线虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ），Ｇｅｎｂａｎｋ登录号ＡＡＹ１６３５０；Ｄｉｔｕｂ：犬心丝虫（Ｄｉｒｏｉｆｌａｒｉａｉｍｍｉｔｉｓ）Ｇｅｎｂａｎｋ登录号ＡＡＣ１３５４７；Ｃｐｔｕｂ：栉状古柏　线虫（Ｃｏｏｐｅｒｉａｐｅｃｔｉｎａｔａ），Ｇｅｎｂａｎｋ登录号ＡＢＭ９２３４９；Ｏｖｔｕｂ：盘尾丝虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ　ｖｏｌｖｕｌｕ）ｓ，Ｇｅｎｂａｎｋ登录号ＡＡＣ１３５４８；Ｂｍｔｕｂ：马来丝虫（Ｂｒｕｇｉａ　ｍａｌａｙｉ），Ｇｅｎｂａｎｋ登录号ＡＡＵ１２５０；Ｃｃｔｕｂ：碗形盅口线虫（Ｃｙａｔｈｏｓｔｏｍｕｍ　ｃａｔｉｎａｔｕｍ），Ｇｅｎｂａｎｋ登录号ＡＡＴ７６６２１；Ｃｒｔｕｂ：辐射杯环线虫（Ｃｙｌｉｃｏｃｙｃｌｕｓ　ｒａｄｉａｔｕｓ），Ｇｅｎｂａｎｋ登录号ＡＡＭ９５３５３；Ｈｃｍｂ：捻转血矛线虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｔｈｓ），Ｇｅｎｂａｎｋ登录号ＥＦ１９８８６５；Ａｄｔｕｂ：十二指肠钩虫（Ａｎｃｌｏｓｔｆｏｍａ　ｄｕｏｄｅｎａｌｅ），Ｇｅｎｂａｎｋ登录号ＤＱ０５５４１５。　参考文献　ｌｉｎｇ，２００４，２３（３）：２７５—２８４．　［５］Ｃｌｒｋ　Ｈ　ａＪ，ＫａｐｌｎＲＭ，Ｍａｔａｔｈｅｗｓ　ＪＥ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉ—　ｏｎ　ｏｆ　ａ　ｂｅｔａ　ｔｕｂｕｌｉｎ　ｉｓｏｔｙｐｅ　２　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　ｔｗｏ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｃｙａｔｈｏｓｔｏｍｉｎ　［１］金永玲，韩日畴．昆虫病原线虫的研究概况［Ｊ］．昆虫天敌，　２００３，２５（４）：１７５—１８３．　［２］徐忠东，吴琴．微管蛋白的研究进展［Ｊ］．安徽教育学院学报，　１９９９，１１（２）：７３—７４．　［３］　Ａｍｏｓ　Ｌ．Ｂｅｎｄｉｎｇ　ａｔ　Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏ—　ｇＹ，２００４，１１（６）：７４５—７４７．　［４　Ｊ　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｍ　Ｗ，ＭｃＦｅｒｒａｎ　Ｎ，Ｔｒｕｄｇｅｔｔ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｐｓｓｉｂｌｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　Ｂ—ｔｕｂｕｌｉｎ　ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ　ｂｙ　ｉｎｖｏｋｉｎｇ　ａｎ　ｉｎｔｅｒ—　［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｆｏｒ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，２００５，３５（４）：３４９—　３５８．　［６］Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ，Ｒｕｓｓｅｌｌ　Ｄ　Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌｒ　ａＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ—　ｌ［Ｍ］．３ｒｄｅｄ．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｃｏｌａｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ－ｌａｂｏｍｔｏｒｙＰｒｅｓｓ．２６—　１１８，６１１—６２７．　［７］　Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ　Ｍ，Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ　Ｔ．Ｂｅｙｏｎｄ　ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｆｒｏｍ　ｍｉｃｍｔｕ—　ｂｕｌｅｓ　ｏｆ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ，１９８６，４５（３）：３２９—３４２．　ｄｏｍａｉｎ　ｍｏｖｅｍｅｎｔ　　ｌＪ　１．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｒａｐｈｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｏｄｅｌ—