青霉素的发酵生产及分离纯化实验结果分析

青霉素的发酵生产及分离纯化实验结果分析

一、发酵控制

（一）发酵温度的控制

1、一般来说，接种后应适当提高培养温度，以利于孢子的萌发或加快微生物的生长、繁殖，而且此时发酵的温度大多数是上升的。随着发酵液的温度逐渐上升，发酵液的温度应该控制在微生物的最适生长温度；到主发酵旺盛阶段温度的控制可比最适生长温度低些，即控制在微生物代谢产物合成的最适温度；到发酵的后期，温度出现下降的趋势，直至发酵成熟即可放罐。

2、工业发酵过程一般无须加热，因为释放的发酵热常常超过微生物的最适生长温度，所以需要冷却阶段较多。通常是利用发酵罐的热交换装置进行降温（如采用夹套或蛇形管进行调温），冬季发酵时空气还需进行加热处理，以便维持发酵的正常温度。

（二）发酵pH值控制

首先应根据不同微生物的特性，不仅要控制原始培养基的pH值，而且在整个发酵过程中，必须随时检测pH值的变化情况，根据发酵过程中的pH值变化规律，选用适当的方法对pH值进行调节和控制。在实际生产中，调节和控制pH值的方法主要有以下几种。

1、调节培养基的原始pH值，或加入缓冲溶液（如磷酸盐）制成缓冲能力强、pH值变化不大的培养基，或使眼泪和碳源的配比平衡。

2、在发酵过程中加入弱酸或弱碱经行pH值调节，进而合理的控制发酵条件；也可通过调整通风量来控制pH值。

3、如果仅用酸或碱调节pH值不能改善发酵情况时，进行补料是一个较好的办法，它既可调节培养基的pH值，又可补充营养，增加培养液的浓度和减少阻遏作用，进一步提高发酵产物产率。

4、采用生理酸性铵盐作为氮源时，可在培养液中加入碳酸钙来调节pH值。但是碳酸钙的加入量一般都很大，在操作上很容易引起染菌。因此，此方法在发酵过程中应用布氏太广。

5、在发酵过程中根据pH值的变化可用流加氨水的方法来调节，同行又可把氨水作为氮源供给。由于氨水作用快，对发酵液的pH值影响波动大，应采用少量多次的流加方法，+以免造成pH值过高，从而抑制微生物细胞的生长，或pH值过低，NH不足等现象。具体的流加方法应根据微生物的特性、发酵过程的菌体生长情况、耗糖情况等来决定，一般控制在pH值7.0～8.0，最好采用自动控制连续流加方法。

6、以尿素作为氮源经行流加调节pH值，是目前国内味精厂普遍采用的方法。尿素分解放出氨，使pH值上升；同时氨和培养基中的营养成分被微生物利用后形成有机酸等中间代谢产物，使pH值降低；此时就需要流加尿素，以调节pH值和补充氮源。反复进行流加就可维持一定的pH值。

7、目前已有用于发酵过程的pH测量电极，可连续测量并记录pH值的变化，用于控制和检测发酵pH值。

（三）提高溶解氧的措施

控制溶解氧的工艺手段主要是从供氧和需氧两方面来考虑。影响溶解氧效果的主要因素有：（1）通气流量（通风量）；（2）搅拌速度；（3）气体组分中的氧分压；（4）罐压；（5）温度；（6）温度；（7）培养基的物理性质等。而影响需氧的则是菌体的生理特性，诸如不同菌龄的呼吸强度差别，基质加入时菌丝耗氧的增加等。工艺上主要的控制手段有以下几种方法。

1、改变通气速率（增大通风量）改变通气速率主要是通过改变体积溶氧系数K来改变供氧能力。有两种情况：A、在La低通气量的情况下，增大通气量对提高溶氧浓度有十分显著的效果；B、在空气流速已经十分高的情况下，再增加通气速率，作用便布氏很明显，反而会产生某些副作用，比如泡沫形成、水分蒸发、罐温增加以及染菌几率增加等。

2、改变搅拌速度一般来说，改变搅拌速度的效果要比改变通气速率大，这是因为：A、通气泡沫被充分破碎，增加有效气液接触面积；B、液流滞流增加，汽泡周围液膜厚度和菌丝表面液膜厚度减小，并延长了汽泡在液体中的停留时间，因而就较有效的增加K，提高了供氧能力。

3、改变气体组成中的氧分压用通入纯氧的方法来改变空气中氧的含量，提高了Kla值，因而提供了供氧能力。纯氧La成本较高，但对于某些发酵，如溶氧低于临界值时，短时间内加入纯氧是有效而可行的，这种方法在实验室动植物细胞培养中已被采用。其他富氧装置也在开发，但因成本核算问题，离实际规模化应用还有距离。

4、改变罐压增加罐压实际上就是改变氧的分压PO来提高液相氧浓度，从而提高供氧能力，但此法不是十分有效。

5、改变发酵液的理化性质在发酵过程中，菌体本省的繁殖及代谢可引起发酵液性质不断改变，例如改变培养液的表面张力、粘度及离子强度等，就会影响培养液中气泡的大小、气泡的溶解性、稳定性以及合并为大气泡的速率。同时发酵液的性质还影响到液体的流动及界面或液膜的阻力，因而显著的影响到氧的溶解速度，而且由于发酵液中菌丝浓度所引起的表观粘度的增加，可使通气速率下降。如果培养基性质为限制氧传递的因素时，就根据具体情况对培养液的某一物理性质稍作改造，例如加消泡剂、补加无菌水、改变培养基成分等都可以改善通气效果，以适应菌的正常生长。

分离纯化实验结果分析

(1)实验确定了从蜡状芽孢杆菌CMCC(B)63301发酵液中分离纯化青震素酶的工艺条件:发酵液离心除菌体,滤液调pPH值至近中性一分级盐析(收集50%f硫酸铆饱和度至75%硫酸铆饱和度的沉淀1一将分级盐析得到的沉淀溶解于PH7.0磷酸盐缓冲液中,超渣脱盐及浓缩一SephadexG-75凝胶柱层析。通过该工艺纯化酶液的比活力为8.2X105U/mg,纯化了11.32倍,酶活力回收率为35.04%。样品经SDS-PAGE电泳得到单一条带,说明已达到电泳纯。

(2)实验测得该青霉素酶的最适作用温度为37C,最适作用PH范围6.5一7.0,在4C下保存120h,酶活力保留90%。添加55%NaCI溶液或5%甘油可延长保存时间,在4C下保存15d时的酶活仍下降很少