一种N-溴代丁二酰亚胺有关物质的检测方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108982694 A(43)申请公布日 2018.12.11

(21)申请号 201810847639.1(22)申请日 2018.07.27

(71)申请人 西藏多瑞医药有限公司

地址 854000 西藏自治区昌都市经济开发

区A区生物医药园1号楼3层(72)发明人 邓勇　吕小倍　

(74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001

代理人 余晓雪(51)Int.Cl.

G01N 30/02(2006.01)G01N 30/06(2006.01)G01N 30/74(2006.01)G01N 30/54(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图11页

(54)发明名称

一种N-溴代丁二酰亚胺有关物质的检测方法

(57)摘要

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种N-溴代丁二酰亚胺中有关物质的检测方法，步骤如下：1.用三乙胺水溶液制备N-溴代丁二酰亚胺待测品溶液；2.开启紫外光吸收检测器，使用波长为190~210nm的紫外光进行检测，然后将步骤1.所得的待测品溶液注入到高效液相色谱仪的色谱柱中，再用流动相以0.7~0.9ml/min流速进行梯度洗脱得到色谱图；可以根据色谱图算出N-溴代丁二酰亚胺及各有关物质的分离度，同时采用峰面积归一化法计算N-溴代丁二酰亚胺待测品中有关物质的含量；所用流动相为磷酸水溶液-乙腈，所用磷酸水溶液的pH为2.0-3.0。本发明的方法具有空白基线无干扰、专属性强、分离度好等特点，其适用于N-溴代丁二酰亚胺中杂质的检测。

CN 108982694 ACN 108982694 A

权　利　要　求　书

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1.一种N-溴代丁二酰亚胺中有关物质的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1.1用三乙胺水溶液配制N-溴代丁二酰亚胺待测品溶液；1.2先开启紫外光吸收检测器，使用波长为190～210nm的紫外光进行检测，然后将步骤1.1所得的待测品溶液注入到高效液相色谱仪的色谱柱中，再用流动相以0.6～1.0ml/min流速进行梯度洗脱，得到待测品的高效液相色谱图；

所述流动相为磷酸水溶液-乙腈混合液，所述磷酸水溶液的pH为2.0-3.0；柱温为35～45℃；

所述三乙胺水溶液中三乙胺的浓度为1.5-2.5v/v％。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述的梯度洗脱程序为：

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述磷酸水溶液的pH为2.5。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1.2中使用波长为200nm的紫外光进行检测。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述三乙胺水溶液中三乙胺的浓度为2v/v％。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：进样量为1ul。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述流动相的流速为0.8ml/min。

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一种N-溴代丁二酰亚胺有关物质的检测方法

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技术领域

[0001]本发明属于分析化学领域，具体涉及一种N-溴代丁二酰亚胺有关物质的检测方法。

背景技术

[0002]现有技术中鲜有关于N-溴代丁二酰亚胺中有关物质的检测方法报告，只有N-溴代丁二酰亚胺的含量测定的方法：

[0003]精确称取N-溴代丁二酰亚胺样品0.2g(准确至0.0001)加100ml蒸馏水溶解，等完全溶解后加冰醋酸5ml，再加15％碘化钾10ml盖紧碘量瓶塞摇匀，用蒸馏水封口，放置暗处15分钟后取出振摇，然后用0.1N硫代硫酸钠标准溶液定至终点时，颜色由红棕色转变为浅黄色，加2ml 0.5％淀粉指示剂振摇，滴定至蓝色消失。[0004]但是此方法只是针对主成分的含量进行测定，并不能测得每个杂质的具体量或者分布，在使用N-溴代丁二酰亚胺作为原料进行化学反应的过程中，每个杂质的含量以及分布情况对后续的反应都有直接的影响，甚至直接影响终产品中杂质的多少，但是实际应用时，在N-溴代丁二酰亚胺原料的主成分含量基本相同的情况下，不同厂家、不同批次的原料制备出的中间体或终产品的品质区别也比较大，可能是其中的有关物质含量分布存在着较大的差别所导致的，但是目前的原料检测方法并不能检测出其中有关物质的分布情况，导致不能对原料进行有效的判断以及筛选，故需要针对此问题开发一种针对杂质测定的直观的方法。此方法可以测定N-溴代丁二酰亚胺中杂质分布情况，故而可以解决这一难题。发明内容

[0005]基于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种N-溴代丁二酰亚胺中有关物质的检测方法，可以对N-溴代丁二酰亚胺的质量进行更好的控制。[0006]本发明的N-溴代丁二酰亚胺有关物质的检测方法，是采用高效液相色谱法实现。[0007]所述方法包括：[0008](1)用三乙胺水溶液配制N-溴代丁二酰亚胺待测品溶液；[0009](2)先开启紫外光吸收检测器，使用波长为190～210nm的紫外光进行检测(优选为200nm)，然后将步骤(1)所得的待测品溶液注入到高效液相色谱仪的色谱柱中，再用流动相以0.6～1.0ml/min流速进行梯度洗脱(优选为0.8ml/min)，得到待测品的高效液相色谱图。[0010]本发明中根据检测到的色谱图可以有效显示N-溴代丁二酰亚胺待测品中杂质的分布，从而可以判断待测品的质量稳定性，选择杂质稳定的N-溴代丁二酰亚胺原料从而保障所需产品的品质稳定性，在实际应用中可根据色谱图算出N-溴代丁二酰亚胺及各有关物质的分离度，同时采用峰面积归一化法计算N-溴代丁二酰亚胺待测品中有关物质的含量。[0011]所述流动相为磷酸水溶液-乙腈混合液，所述磷酸水溶液的pH为2.0-3.0(优选为pH＝2.5)；

[0012]柱温为35～45℃(优选为40℃)；

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所述三乙胺水溶液中三乙胺的浓度为1.5-2.5v/v％，优选为为2v/v％。

[0014]进一步地，所述色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，更进一步地，所述色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm。[0015]进一步地，进样量为1ul。[0016]所述的梯度洗脱程序为：[0017]表1

[0018]

时间(分钟)磷酸水溶液(体积％)乙腈(体积％)09911099120010030010030.199135991[0019]本发明中，术语“N-溴代丁二酰亚胺”在没有明确区分的情况下，可以是N-溴代丁二酰亚胺的纯品、原料药、合成品等以N-溴代丁二酰亚胺作为主成分的产品。本发明的测定方法均适用于上述产品的检测，并且这些产品的有关物质的测定方法也包含于本发明的保护范围内。

[0020]本发明中，术语“有关物质”是指在N-溴代丁二酰亚胺制备和贮存过程中可能产生的杂质。

[0021]与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：[0022]本发明的检测方法具有空白基线无干扰、专属性强、分离度好等特点，其适用于N-溴代丁二酰亚胺中有关物质的检测，采用液相的方法可以更直观更全面地反映N-溴代丁二酰亚胺的质量及不同厂家、不同批次N-溴代丁二酰亚胺的具体差异。附图说明

[0023]图1为实施例1中空白溶液的高效液相色谱图。

[0024]图2为实施例1中溴化钠定位溶液的高效液相色谱图。

[0025]图3-5为实施例1中N-溴代丁二酰亚胺的高效液相色谱图，图3为NBS-170106的高效液相色谱图，图4为NBS-170612的色谱图，图5为NBS-20170226的高效液相色谱图。[0026]图6为实施例2中N-溴代丁二酰亚胺的高效液相色谱图。

[0027]图7-9依次为对比例1-3中N-溴代丁二酰亚胺的高效液相色谱图。

[0028]图10-12为对比例4中利用3个不同稀释剂稀释后N-溴代丁二酰亚胺的高效液相色谱图，其中图10为用稀释剂1稀释的N-溴代丁二酰亚胺样品的高效液相色谱图，图11为用稀释剂2稀释的N-溴代丁二酰亚胺样品的高效液相色谱图，图12为用稀释剂3稀释的N-溴代丁二酰亚胺样品的高效液相色谱图。

具体实施方式

[0029]下面用具体实施例来进一步解释和说明本发明的技术方案，但以下实施例并不以

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任何方式限制本发明的范围。

[0030]本发明实施例和对比例中所使用的试剂均从市场上购得，其中NBS-170106和NBS-170612为购自南通建如化工有限公司的不同批次的N-溴代丁二酰亚胺纯品，NBS-20170226为购自太仓市鑫鹄化工有限公司的N-溴代丁二酰亚胺纯品。[0031]实施例1[0032](1)检测条件[0033]仪器：Thermo U-3000高效液相色谱仪，检测器：紫外检测器，检测波长：200nm；[0034]色谱柱：Waters Symmetry C18(5um，4.6*250mm)；[0035]流动相：流动相A-流动相B混合液，pH＝2.5磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；

[0036]柱温：40℃；[0037]流速：0.8ml/min；[0038]进样量：1ul；[0039]稀释剂：2v/v％的三乙胺水溶液。[0040]按表2的程序进行线性梯度洗脱。[0041]表2

[0042]

时间(分钟)流动相A(体积％)流动相B(体积％)09911099120010030010030.199135991[0043](2)检测方法

[0044]供试品溶液的配制：精密称取N-溴代丁二酰亚胺10mg置于10ml量瓶中，用稀释剂定容至刻度，其pH值为碱性，摇匀，作为供试品溶液。[0045]空白溶液：2v/v％的三乙胺水溶液。[0046]溴化钠定位溶液：称取溴化钠适量，用稀释剂稀释成1mg/ml的溶液，作为定位溶液。

[0047]分别取空白溶液、溴化钠定位溶液和供试品溶液，按照上述条件进行HPLC分析并记录色谱图，本实施例中分别用NBS-170106、NBS-170612和NBS-20170226作为供试品进行了检测，结果见图1(空白溶液)、图2(溴化钠定位溶液)、图3(NBS-170106)和图4(NBS-170612)和图5(NBS-20170226)。图3中各组分按出峰先后顺序分离度分别为4.21、4.11和44.8，图4中各组分按出峰先后顺序分离度分别为5.38、8.92，图5中各组分按出峰先后顺序分离度分别为3.82、10.39、15.63、4.82、4.65、38.56，结果表明，该方法可以实现N-溴代丁二酰亚胺及其杂质的完全分离，且空白基线在供试品出峰位置无干扰，检测灵敏度高。[0048]实施例2

[0049]按照实施例1的检测条件和方法进行操作，区别是将实施例1中紫外检测器波长替

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换为210nm，用实施例1中配制的供试品溶液NBS-20170226作为供试品，其色谱图见图6。[0050]结果表明，该方法可实现N-溴代丁二酰亚胺及其杂质的完全分离，且空白基线无干扰，灵敏度高。[0051]对比例1[0052](1)检测条件[0053]仪器：Thermo U3000高效液相色谱仪，检测器：紫外检测器，检测波长200nm；[0054]色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18(2.7um 4.6*150mm)；[0055]流动相：流动相A-流动相B混合液，水为流动相A，乙腈为流动相B；[0056]柱温：40℃；[0057]流速：0.9ml/min；[0058]进样量：1ul；[0059]稀释剂：2v/v％的三乙胺水溶液。[0060]按表3的程序进行线性梯度洗脱。[0061]表3

[0062]

时间(分钟)流动相A(体积％)流动相B(体积％)0851515703015.18515198515[0063](2)检测方法

[0064]按照实施例1的检测方法进行操作，用实施例1中配制的供试品溶液NBS-170612作为供试品进行检测，其N-溴代丁二酰亚胺样品的色谱图见图7，没有检测出相应的分离度值，各杂质并未达到分离。[0065]结果表明，N-溴代丁二酰亚胺主峰出峰时间太早，与附近杂质没有达到基线分离。[0066]对比例2[0067](1)检测条件[0068]仪器：Thermo U3000高效液相色谱仪，检测器：紫外检测器，检测波长200nm；[0069]色谱柱：AgelaVenusil MP-C18(5um 4.6*250mm)；[0070]流动相：流动相A-流动相B混合液，水为流动相A，乙腈为流动相B；[0071]柱温：40℃；[0072]流速：0.9ml/min；[0073]进样量：1ul；[0074]稀释剂：2v/v％的三乙胺水溶液。[0075]按表4的程序进行线性梯度洗脱。[0076]表4

[0077]

时间(分钟)0流动相A(体积％)80

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流动相B(体积％)20

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(2)检测方法

[0079]按照实施例1的检测方法进行操作，用实施例1中配制的供试品溶液NBS-170612作为供试品进行检测，其N-溴代丁二酰亚胺样品的色谱图见图8，没有检测出相应的分离度值，各杂质并未达到分离。[0080]结果表明，N-溴代丁二酰亚胺主峰出峰时间太早，与附近杂质完全堆在一起。[0081]对比例3[0082](1)检测条件[0083]仪器：Thermo U3000高效液相色谱仪，检测器：紫外检测器，检测波长200nm；[0084]色谱柱:AgelaVenusil MP-C18(5um 4.6*250mm)；[0085]流动相：磷酸水溶液-乙腈混合液，磷酸水溶液的pH＝2.5，其与乙腈的体积比为97:3；

[0086]柱温：40℃；[0087]流速：0.9ml/min；[0088]进样量：1ul；[0089]稀释剂：2v/v％的三乙胺水溶液。[0090](2)检测方法

[0091]按照实施例1的检测方法进行操作，用实施例1中配制的供试品溶液NBS-170612作为供试品进行检测，其N-溴代丁二酰亚胺样品的色谱图见图9，没有检测出相应的分离度值，各杂质并未达到分离。[0092]结果表明，N-溴代丁二酰亚胺主峰出峰时间太早，与附近杂质完全堆在一起。[0093]对比例4[0094](1)检测条件[0095]仪器：Thermo U3000高效液相色谱仪，检测器：紫外检测器，检测波长：200nm；[0096]色谱柱：Waters Symmetry C18(5um 4.6*250mm)；[0097]流动相：磷酸水溶液-乙腈混合液，pH＝2.5磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；

[0098]柱温：40℃；[0099]流速：0.9ml/min；[0100]进样量：1ul；[0101]稀释剂1：蒸馏水；[0102]稀释剂2：pH＝2.5磷酸水溶液；[0103]稀释剂3：2v/v％的三乙胺水溶液；[0104]按表5的程序进行线性梯度洗脱。[0105]表5

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时间(分钟)流动相A(体积％)流动相B(体积％)0955595515010020010020.195525955[0107](2)检测方法

[0108]按照实施例1的检测方法进行操作，其中，供试品溶液的配制：精密称取N-溴代丁二酰亚胺NBS-170612 10mg置于10ml量瓶中，分别用上述不同的稀释剂定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。[0109]用稀释剂1稀释的N-溴代丁二酰亚胺的色谱图见图10，用稀释剂2稀释的N-溴代丁二酰亚胺样品的pH为酸性，其色谱图见图11，用稀释剂3稀释的N-溴代丁二酰亚胺样品的pH为碱性，其色谱图见图12。[0110]结果表明，用蒸馏水稀释后的N-溴代丁二酰亚胺以及用磷酸水溶液将pH调为酸性后的N-溴代丁二酰亚胺样品溶液的主峰与杂质均未分离，而用三乙胺水溶液将pH调为碱性的N-溴代丁二酰亚胺样品的色谱图峰形良好且与周围杂质完全分离。

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