２０１２年第４期 粮食与油脂 食品病原微生物快速检测技术及研究进展 王辉，张伟，王燕，顾希 （山东东营出入境检验检疫局， 山东东营２５７０９１） 摘要：食品病原微生物传统检验方法费时、敏感度低、特异性差；随社会和食品工业快速发展， 研究和建立食品病原微生物快速检测方法越来越受到世界各国重视。该文介绍免疫学技术、分子 生物学技术、代谢技术、仪器分析技术、生物传感器技术等检测微生物基本原理，及这些技术在食 品病原微生物检测中研究进展。 关键词：病原微生物；食品检测；食品安全 Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｉｎ ｌ００ｄＳ ＷＡＮＧ Ｈｕｉ，ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉ，ＷＡＮＧ Ｙａｎ，ＧＵ Ｘｉ （Ｄｏｎｇｙｉｎｇ Ｅｎｔｒｙ－Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ。Ｄｏｎｇｙｉｎｇ ２５７０９１。Ｓｈａｎｄｏｎｇ。Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｒｅ ｔｉｍｅ－ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ，ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｈｙｐｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｆｏｏｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｃｉｅｔｙ ａｎｄ ｆｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ，ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｆｏｏｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｙ ｐａｉｄ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｔｏ ｂｙ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｕｎｔｉｒｅｓ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ，ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｍｅｔａｂｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｔｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｏｎ ｆｏｏｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｅｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ；ｆｏｏｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ｆｏｏｄ ｓａｆｅｔｙ 中图分类号：ＴＳ２０７．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１ｏ０８—９５７８（２０１２）０４—０００１一Ｏ５ 随着世界经济全球化、贸易自由化和食品工业化 华等…利用副溶血弧菌免疫家兔制备多克隆血清，建 迅速发展，食品安全已成为全球关注热点问题，而食 立中国对虾病原菌一副溶血弧菌间接荧光抗体检测 品中病原微生物是影响食品安全最主要因素。食品病 技术，不仅可用于诊断发病感染对虾，也可用于检测 原微生物传统检验方法步骤非常繁琐，需耗费大量人 带菌状态或未发病感染对虾。 力、物力，且检测周期长、灵敏度较低，难以满足目前 １．２酶免疫技术 国内外对食品安全检测要求。因此，研究和建立灵敏 酶免疫技术是利用抗原、抗体反应高度特异性和 度更高、特异性更强、简便快捷食品病原微生物快速 酶促反应高度敏感性，通过肉眼或显微镜观察及分 检测技术迫在眉睫。本文对目前国内外改进和开发一 光光度计测定，达到在细胞或亚细胞水平上示踪抗原 些病原微生物快速检测技术及其在食品方面应用进 或抗体部位，及对其进行定量目的。根据抗原、抗体 行综述。 反应是否需要分离结合和游离酶标记物而分为均相 １免疫学技术 和非均相两种类型。非均相法较常用，包括液相与 免疫学检测技术是应用免疫学理论而设计一系 固相两种免疫测定法。非均相酶固相免疫测定法即 列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌细胞因子的实 ＥＬＩＳＡ在目前应用最为广泛。Ｃｒｙａｎ等 在研究大 验方法，其基本原理是利用抗原、抗体间能发生特异 肠埃希氏杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．）内毒素时，将ＥＬＩＳＡ 性免疫反应以检测病原。 法与ＤＮＡ探针技术等进行比较，发现ＥＬＩＳＡ技术更 １．１免疫荧光技术（ＩＦＴ） 灵敏、快速。此外，ＥＬＩＳＡ法还可用于食品介导病毒 免疫荧光技术是将不影响抗原、抗体活性的荧光 检测。葛翠翠等Ｂ 使用双抗夹心ＥＬＩＳＡ检测食品中 色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应抗原（或抗体） 大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７，结果表明，该法稳定性、重复性 结合后，形成免疫复合物在一定波长光激发下可产生 良好，对纯培养菌液检出限为１０ ｃｆｕ／ｍＬ，具有良好敏 荧光，借助荧光显微镜可检测或定位被检抗原。目前 感性及特异性。杨静 等用沙门氏菌特异性单克隆 免疫荧光技术可用于沙门氏菌、葡萄球菌毒素、Ｅ．Ｃｏｌｉ 抗体ＣＢ８和ｄｅ７建立直接检测沙门氏菌方法，即用被 Ｏ１５７和单核细胞增生李斯特氏菌等快速检测。张晓 检样品直接包被ＥＬＩＳＡ板固定加酶标抗体作用一段 收稿日期：２０１２－０３－０６ 作者简介：王辉（１９８２￣），男，工程师，硕士，研究方向：食品微生物快速检测。 ２ 粮食与油脂 ２０１２年第４期 时间后，加入底物显色后终止反应。目前已成功应用 于蛋品、鲜奶、肉制品中沙门氏菌检测，与传统方法相 比，其敏感性和特异性均达到理想效果。窦勇等 以 副溶血弧菌１．２１６４作为抗原，免疫新西兰兔获得效价 为１．６１０５多克隆抗体，以此多克隆抗体作为一抗，山 羊抗兔ＩｇＧ－ＨＲＰ作为酶标二抗，建立副溶血弧菌间 接ＥＬＩＳＡ快速检测法。结果表明，此法在６ ｈ内即可 检测出浓度为１０ ｃｆｕ／ｍＬ副溶血弧菌，且与其它菌株 均无交叉反应。 １－３免疫印迹技术 免疫印迹技术又称转移印迹技术，是以生物物理 学方法（凝胶电泳高效分离）与特异性免疫反应（固 相免疫测定）相结合而建立技术。其借助高分辩率 ＰＡＧＥ电泳将混合蛋白质样品有效分离成许多蛋白区 带，分离后蛋白经电泳转移至固相支持物，通过与特 异性抗体结合，即可定性或定量检测靶蛋白。免疫印 迹技术综合ＳＤＳ－ＰＡＧＥ高分辨率及ＥＬＩＳＡ高敏感性 和高特异性，是一种有效分析手段，目前应用于酵母 和真菌检测。 １．４免疫层析技术 免疫层析技术将免疫学原理与层析原理相结合， 借助毛细管作用，样品在条状纤维制成膜上泳动，其 中待测物与膜上一定区域配体结合，通过酶促显色反 应或直接使用着色标记物，在短时间内（２０ ｍｉｎ内）便 可得到直观结果。免疫层析按其原理可分为两类：一 类以酶促反应显色为基础，以显色高度来定量；另一 类则使用着色标记物，如乳胶颗粒、胶体硒、胶体金及 脂质体等，层析时，标记物与待测物被相应配体捕获 而浓集显色，以纤维膜上显色条有无或多少以定性或 定量 。目前在检验微生物时常用的是免疫胶体金 技术。罗立新等 选用柠檬酸钠改良法制备胶体金， 测定其最适结合蛋白浓度为２８ ｇｇ／ｍＬ，构建免疫层 析检测试剂和检测方法，检测冷冻猪肉、牛奶、冰激凌 及不同稀释度的产单核李斯特菌标准样品，灵敏度达 ８７．５％，具有良好重现性。 １．５免疫磁珠分离技术 免疫磁珠分离技术是将免疫学反应高度特异性 与磁珠特有磁响应性相结合一种新免疫学技术。其基 本原理是利用人工合成内含铁成分、可被磁铁磁力所 吸弓ｌ、外有功能基团、可结合活性蛋白质（抗体）磁珠， 作为抗体载体。当磁珠上抗体与相应微生物或特异性 抗原物质结合后，则形成抗原一抗体一磁珠免疫复合 物。这种复合物具有较高磁响应性，在磁铁磁力作用 下定向移动，使复合物与其它物质分离，从而达到分 离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质目的。 ｓ ｅｒｖｅ等鸭 用免疫磁珠分离技术从乳及乳制 品、肉类和蔬菜中分离出沙门氏菌，其检测限为１０个 ～２０个／ｇ细菌。Ｔｏｍｏｙａｓｕ 应用免疫磁性分离技 术从引起中毒食物中成功分离出副溶血性弧菌。张凡 非等ｎ０ 采用免疫磁珠法分离海水海泥和蛤肉中副溶 血性弧菌，将磁珠与副溶血性弧菌免疫血清混合，制 备免疫磁珠，用于分离样品中细菌，分离出菌株接种 平板并进行常规鉴定，结果此法较一般培养分离法极 大提高检出率。 １．６酶联荧光免疫分析技术 酶联荧光免疫分析技术是在酶联免疫吸附分析 基础上发展而成一种快速检测微生物方法。其基本 原理：首先将已知抗体吸附于固相载体，加入待测样 本，样本中抗原与固相载体上抗体结合，然后酶标抗 体再与样本中抗原结合；加入酶反应底物，底物被酶 催化为带荧光产物，产物量与标本中受检物质量直接 相关，然后根据荧光强度进行定性或定量分析。陈思 强等… 评价自动酶联荧光免疫分析系统（ＶＩＤＡＳ） 检测冻肉中沙门氏菌灵敏度和特异性，使用ＶＩＤＡＳ 法和常规细菌培养法平行检测各种冻肉样品中沙门 氏菌，以常规细菌培养法作参照，对ＶＩＤＡＳ技术进 行评价。结果在１５５份样品中，ＶＩＤＡＳ法检出沙门 氏菌阳性ｌ０例，阴性１４５例；常规细菌培养法检测 出ＶＩＤＡＳ法阳性样本中９例呈阳性，其余１４６例皆 为阴性。ＶＩＤＡＳ法用于冻肉沙门氏菌检测灵敏度为 １００％、特异性为９９％。 １．７乳胶凝集试验 乳胶凝集试验是利用抗原、抗体特异性结合特 点，加上人工大分子乳胶颗粒标记抗体，使之与待 测抗原发生肉眼可见凝集反应，以达到检测目标病 原微生物或毒素目的。此法可用于鉴定大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７等。 ２分子生物学技术 ２．１基因探针技术 基因探针技术又称核酸分子杂交技术，该技术于 １９６８年由华盛顿卡内基学院Ｂｆｉｕｅｎ等共同创建。其 原理是从微生物中提取或扩增特异性ＤＮＡ片段，纯 化后再将此ＤＮＡ片段标记上可被检测指示剂，如放 射性同位素、荧光物质等，使之成为特异性ＤＮＡ探针。 微生物经处理后固定于另一固相表面上，经洗涤变性 后加入ＤＮＡ探针进行杂交，ＤＮＡ探针可与同源性靶 ＤＮＡ进行互补性结合，依据指示剂选用合适方法进行 检测 １ ２］。 ２０１２年第４期 粮食与油脂 ３ 目前，国内外研究者已开发出多种基因探针用于 期由美国ＡｆｆｙｍｅＵ－ｔｘ公司发明，是采用原位合成或显 食品微生物检测。Ｋｅｒｄａｈｉ等“。 使用自动化酶连接的 微打印手段，将数以万计核酸探针固化于支持物表面， 非放射性ＤＮＡ探针，迅速准确检测出单核细胞增生李 与标记样品进行杂交，通过检测杂交信号实现对样品 斯特菌。陈倩等ｎ 针对ＥＳＩＥＣ大肠杆菌ＨＰＩ毒力岛 快速检测。基因芯片技术是基于芯片上探针与样品中 基因设计ｑ，－ｚ探针，成功鉴定出ＥＳＩＥＣ大肠杆菌。王 靶基因片段之间发生特异性核酸杂交。Ｗａｎｇ等 们 建龙ｎ 采用荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）技术检测水体中大 采用基因芯片技术在４ ｈ内快速检测出食物中致病 肠菌群研究，结果表明，ＦＩＳＨ技术可用于饮用水中大 菌，准确率为９７．４％。Ｃｈｉｚｈｉｋｏｖ等 ¨采用寡核苷酸 肠菌群检侧，且在较短时间内（６ｈ）得出定量分析结果。 芯片研究大肠杆菌、志贺氏菌及沙门氏菌抗原决定簇 ２．２ ＰＣＲ技术 和毒力因子与其致病性关系，发现细菌毒力因子可用 聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ） 于肠道致病菌分析检测。 技术于１９８５年由美国ＰＥ－Ｃｅｔｕｓ公司和加州大 ２．４核酸恒温扩增技术 合创建。其基本原理是：首先将靶ＤＮＡ双链加热变 ＰＣＲ技术在反应过程需不断变换温度，应用时 性为单链，然后加入两段人工合成的、与靶ＤＮＡ两端 不够方便，于是恒温扩增技术应运而生。核酸恒温扩 互补的、寡核苷酸片断作为引物，即左端引物和右端 增技术是在恒定温度下实现ＤＮＡ或ＲＮＡ分子数目 引物。该对引物与互补ＤＮＡ单链碱基互补结合后， 增加技术，其中应用较广泛的是环媒恒温扩增技术 在有ＤＮＡ聚合酶和４种ｄＮＴＰｓ底物存在情况下，引 （Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａ Ａｍｐｆｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）。其 物沿模板ＤＮＡ链按５，．３ 方向延伸，自动合成新的 是由日本学者Ｎｏｔｏｍｉ等开发一种新型核酸恒温扩增 ＤＮＡ双链，新合成ＤＮＡ双链又可作为扩增模板，继 方法，其基本原理是采用４条特异引物及一种具有链 续重复以上ＤＮＡ多聚酶链反应。经高温变性（ＤＮＡ 置换活性ＤＮＡ聚合酶，在６５℃左右对核酸进行扩增， 双链解开）、低温退火（引物与模板结合）和中温延伸 短时间扩增效率可达到１ｏ９～１０ 。个拷贝。Ｓｏｎｇ等眨 （合成新的ＤＮＡ片断）三个阶段循环周期，对ＤＮＡ 用ＬＡＭＰ检测志贺氏菌属和肠道侵袭性大肠埃希氏 分子进行２５￣３５次循环扩增，可将靶ＤＮＡ序列扩 菌，以ｉｐａＨ基因为目标，起始模板仅为８ ｃｆｕ，扩增反应 增近百万倍。自ＰＣＲ技术发明以来，经发展并结合 可在２ ｈ内完成。黄帆等 以结核分支杆菌（Ｍ．ＴＢ） 其它技术衍生出许多ＰＣＲ优良技术，如反转录ＰＣＲ、 作为研究对象，设计４种ＬＡＭＰ引物以特异性识别 Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ、荧光定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ等。 结核分支杆菌中ｇｙｒＢ基因六个特殊区域，着重利用 Ｌｕｋｅ等¨ 利用Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法３ ｈ内可从鸡 ＬＡＭＰ技术在几种常见致病分支杆菌中能快速、特异 肉中检出沙门氏菌。Ｒｕｄｉ等Ｈ 采用实时定量ＰＣＲ 性检测出结核分支杆菌。实验结果表明，ＬＡＭＰ技术 技术，快速检测出食品样品中单核细胞增多性李斯特 能在恒温（６３℃）条件下，１ ｈ内检测出结核分支杆菌。 菌。杨洋等Ｈ引采用ＰＣＲ法实际检测乳品中金黄色 ３代谢技术 葡萄球菌，同时与国标ＧＢ４７８９．１０—９４方法及两种快 ３．１ ＡＴＰ生物发光法 速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片Ｐｅｔｒｉｉｆｌｍ ＲＳＡ． ＡＴＰ生物发光技术原理是荧光素酶（Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｃｏｕｎｔ Ｐｌａｔｅ及Ｂａｉｒｄ－ｐａｒｋｅｒ＋ＲＰＦ Ａｇａｒ进行比较。结 Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）以 荧光素（Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）、三磷酸腺苷 果以ＰＣＲ方法灵敏度为高，全脂乳和脱脂乳检出限为 （ＡＴＰ）和氧气为底物，在存在Ｍｇ 时，可将化学能转 １０ ｃｆｕ／ｍＬ，奶酪检出限为５５ ｃｆｕ／ｇ，可在６ ｈ内完成对 化为光能，发出光量子。ＡＴＰ既是荧光素酶催化发光 乳品中金黄色葡萄球菌检测，比目前普遍采用先增菌 必需底物，又是所有生物生命活动能量来源。在荧光 再进行ＰＣＲ检测方法缩短１２￣２４ ｈ；与国标方法相 素酶催化发光反应中，ＡＴＰ在一定浓度范围内，其浓 比，ＰＣＲ方法符合率为９４．３％、敏感性为１００％。蒋鲁 度与发光强度呈线性关系，各生长期细菌均有较恒定 岩等ｎ 为同时测定食品中副溶血性弧菌和金黄色葡 水平ＡＴＰ含量。因此，提取细菌ＡＴＰ，利用生物发光 萄球菌，建立基于ＴａｇＭａｎ探针双重Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ（实时） 法测出ＡＴＰ含量后，即可推算出样品中含菌量，整个 ＰＣＲ方法。该法对２种细菌菌液检测敏感度均低于 过程仅为十几分钟。 １０ ｃｆｕ／ＰＣＲ反应体系，相关系数均为１．００，整个试验 ３．２电阻抗技术 可在２ｈ内完成。 电阻抗法是通过测量微生物代谢引起培养基电 ２．３基因芯片技术 特性变化以测定样品微生物含量一种快速检测方法。 基因芯片技术（ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ）是二十世纪９０年代中 其原理是微生物在培养过程中，生理代谢作用使培养 ４ 粮食与油脂 ２０１２年第４期 基中电惰性物质（如碳水化合物、类脂、蛋白质）转化 为电活性物质，脂肪代谢为重碳酸盐，大分子物质转 化为小分子物质。随微生物增长，培养基中电活性分 子和离子逐渐取代电惰性分子，使导电性增强，电阻 抗降低。研究表明，电导率随时间变化曲线与微生物 生长曲线出奇相似，出现缓慢增长期、加速增长期、指 数增长期和缓慢减少期，最后趋于稳定期。微生物起 始数量不同，出现指数增长期时间也不同，通过建立 二者之间关系，就能通过检测培养基电特性变化推演 出微生物原始菌量 钔。Ｐｌｅｓｓ等［２５ ３分别用电阻抗法 和传统检测方法进行对照试验，对２５０种食品样品进 行检测。在１２２种沙门氏菌阳性样品中，用电阻抗方 法检出的有１１９种，传统亚硒酸盐一胱氨酸培养基检 出１０６种，用ＲＶ培养基仅检出９２种。 ３．３放射测量技术 放射测量技术是利用细菌在生长繁殖过程中代 谢碳水化合物而产生ＣＯ２原理。将微量放射性ＨＣ 标记引入碳水化合物分子中，在细菌生长时，这些底 物被利用并释放出含放射性ＣＯ２，然后通过自动化放 射测定仪Ｂａｃｔｅｃ测量ＨＣ含量，从而判断细菌数量。 减改华等 印应用放射测量法对大肠杆菌定量检测。 ３．４微热量计技术 微热量计技术是通过测定细菌生长时热量变化进 行细菌检出和鉴别。微生物在生长过程中产生热量， 虽产生量很小，但仍能通过敏感微热量计进行测量。 用微热量计对微生物计数时，温谱图必须与绝对微生 物细胞数呈相关性，一旦建立参考温谱图，食品样品温 谱图便可与之相对照，从而得到微生物绝对数量。 ３．５接触酶测定技术 接触酶测定技术是通过计算一个含有接触酶纸 盘，在盛有Ｈ２０２试管中漂浮时间来估计菌数。接触 酶与Ｈ２０２之间产生生化反应，放出氧气，使纸盘由试 管底部浮到表面。大多数微生物是嗜冷性细菌， 且大多数嗜冷细菌接触酶呈阳性，故可用接触酶反应 估计食品中嗜冷性菌群 。 ４仪器分析技术 ４．１气相色谱法（ＧＣ）和高效液相色谱法（ＨＰＬＣ） 气相色谱法（ＧＣ）和高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）检 测微生物原理主要是依据不同微生物化学组成或其 产生代谢产物各异。利用上述色谱检测可直接分析 各种体液中细菌代谢产物、细胞中脂肪酸、蛋白质、氨 基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物特异性化学标 志成分，协助病原诊断和检测。其中气相色谱应用较 多，其原理是将微生物细胞经水解、甲醇分解、提取及 硅烷化、甲基化等衍生化处理后，使之分离尽可能多 化学组分供气相色谱仪进行分析。不同微生物所得到 色谱图中。通常大多数峰呈共性，仅有少数峰具有特 征性，可被用以进行微生物鉴定，大量分析检测各种 常见细菌、酵母菌、霉菌等。 ４．２毛细管电泳（ＣＥ）技术 毛细管电泳系泛指以高压电场为驱动力，以毛细 管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配 行为差异而实现分离的一类分离技术。Ｅｂｅｒｓｏｌｅ和 ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ用ＣＥ对粪肠球菌、化脓链球菌、无乳链球 菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌５种细菌进行分离， 发现不同发育阶段菌体细胞对应着不同特征峰，且大 多数细菌在电泳后仍能保持活体状态，活体细菌在线 检测可为微生物分析提供新的快速分析方法 引。 ４．３质谱技术 质谱技术检测和鉴定微生物主要基于质谱图中 是否存在特异性生物标记物分子离子。不同微生物具 有不同质谱图，即微生物指纹图谱，采用新型质谱软 电离方法可获得微生物质谱图，将实验得到质谱图与 已被编入质谱指纹图库中已知微生物指纹图谱进行 比对，即可达到检测和鉴定微生物目的。 ４．４微生物自动检测仪 微生物自动检测仪是微生物检测发展方向之一。 国内外已问世全自动微生物分析系统有Ｖｉｔｅｋ系统、 Ｂｉｏｌｏｇ系统、Ｍｉｄｄ系统、Ｓｅｎｓｉｔｉｔｒｅ系统、Ａｕｔｏｓｃｅｐｔｏｒ系 统、ＢＡＸ系统和Ｐｈｏｅｎｉｘ细菌鉴定／药敏试验系统等。 Ｖｉｔｅｋ－Ａｍｓ系由美国麦道保健系统公司制成全自 动微生物分析系统，该装置最大特点在于与应用微生 物检测传统方法有着明显变革，无须经微生物分离培 养和纯化过程，就能从样品直接检出特殊微生物种类 和菌群，该系统已被国际分析化学协会（ＡＯＡＣ）列为 法定分析法。在原有Ｖｉｔｅｋ－Ａｍｓ基础上，美国麦道公 司又推出第二代检测系统，即Ｖ￣ｅｃｋ免疫诊断检测系 统（ＶＩＤＡＳ），其为集固相吸附、酶联免疫、荧光检测和 乳胶凝集诸方法优点于一体的综合性检测系统。 ４．５流式细胞仪 流式细胞术（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，ＦＣＭ）是采用流式 细胞仪对单个细胞或其它生物微粒进行快速定性、定 量分析与分选一门技术。流式细胞仪主要由细胞流动 室（包括样品管、鞘液管）、激光聚焦区、检测系统、数据 处理系统等４部分组成，其工作原理是将被检测对象 制备成一定浓度细胞（微粒）悬液，经荧光染色后，放 入流式细胞仪样品管中，细胞在气体压力下进入鞘液 管，在鞘液约束下，细胞（微粒）排列成单列从流动室 ２０１２年第４期 粮食与油脂 ５ 喷嘴高速喷出成为细胞（微粒）液粒，经荧光染色后细 ［９］Ｔｏｍｏｙａｓｕ Ｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ 胞经激光聚焦区时受激光激发，产生散射光和荧光信 ｍｅｔｈｏｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｋ ａｎｄ ｉｔｓ 号，通过一些波长选择通透性滤光片，可将不同波长 ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｆｏｏｄ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａ１．， １９９２，５８（８）：２６７９—２６８２． 散射光和荧光信号区分而将单个细胞（微粒）液滴分 ［１Ｏｌ张凡非，杉山宽治，西尾智裕，等．利用免疫磁珠法分离环境及 离，并由计算机进行图象及数据处理。该仪器已被用 食品中产生ＴＤＨ副溶血性弧菌的研究［Ｊ］．中国卫生监督杂志， 于ＤＮＡ含量、染色体组成及细胞表面标记等物质测 ２００４，ｌ１（１）：９—１１． 定 。 ［１１］陈思强，钟伟强，曾镇兴，等．自动酶联荧光免疫分析系统检测 冻肉中沙门菌的评价［Ｊ］．中国国境卫生检疫杂志，２００４（５）： ５生物传感器技术 ３０９—３１Ｏ． 生物传感器研究起源于２０世纪６０－年代，是利用 ［１２］曾庆梅，张冬冬，杨毅，等．食品微生物安全检测技术［Ｊ］．食品 生物活性物质（即生物元件）作为敏感器件，配以适当 科学，２００７，２８（１０）：６３２—６３７． ［１ ３］Ｋｅｒｄａｈｉ Ｋ Ｆ。Ｉｓｔａｆａｎｏｓ Ｐ Ｆ．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｓｔｅｒｉａ 换能器（即信号传导器）所构成分析检测工具。其工 ｍｏｎｏｅｙｔｏｇｅｎｅｓ ｂｙ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓ－－ｓａｙａｎｄ 作原理是，待测物质进入固定生物功能敏感元件（由 ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ［Ｊ］．ＪＡＯＡＣ．，２０００，８３（１）：８６—８８． 酶、抗原、抗体、细胞器、完整细胞、激素、核酸等制成） ［１４］陈倩，程伯琨．基因探针检测食品中具有ＨＰＩ毒力岛的ＥＳＩＥＣ 大肠杆菌［Ｊ］．食品科学，２０００，２１（７）：３５． 后，经分子识别而发生生物学反应，产生信息，如光、 ［１５］王建龙．荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）技术检测水体中大肠菌群研究 热等被相应信号转换器转变为可定量和可处理的电 ［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００４，２４（２）：７０—７３． 信号，从而换算出被测物质的量或浓度。目前研究较 ［１６］ＬｕｋｅＴＤ，Ｗｉｌｌｉａｍ ＪＢ，Ｋｅｎｔｏｎｌｌ，ｅｔ ａ１．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 多的有光学传感器技术、生物发光传感器技术、压电 ｏｆ ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｉｎ ｓｕｓｐｅｃｔ ｆｏｏｄｓ ｆｒｏｍ ａ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｉｎ ｋｅｎ ｃｏｕｎｔｙ，ｔｅｘａｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｎｒａｌ ｏｆ Ｃｉｌｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，４０ 免疫传感器技术、表面等离子共振传感器技术、光纤 （８）：３０５Ｏ一３０５２． 传感器技术等。 【１７］Ｒｕｄｉ Ｋ，Ｎａｔｅｒｓｔａｄ ｋ，Ｄｒｅｍｔｏｒｐ Ｓ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ６结束语 ａｎｄ ｄｅａｄ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙ——ｔｏｇｅｎｅｓ ｏｎ ｇｏｕｄａ——ｌｉｋｅ ｃｈｏｏｓｅｓ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ【Ｊ］．Ｌｅｔｔ．Ａｐｐ１．Ｍｉｅｒｏｂｉｏ１．，２００５，４０（４）：３０１— 民以食为天，食以安为先。食品安全至今仍是一 ３０６． 个全球性重大公共卫生问题，食品污染和食源性疾病 ［１８】杨洋，张伟，袁耀武，等．ＰＣＲ检测乳品中金黄色葡萄球菌［Ｊ］． 在生活中普遍存在。尽管新开发食品病原微生物快 中国农业科学，２００６，３９（５）：９９Ｏ一９９６． 速检测技术具有诸多优点；但目前大多尚处实验室 ［１９］蒋鲁岩，蔡潭溪，邵景东，等．应用双重Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ同步定 量检测食品中的副溶血性弧菌及金黄色葡萄球菌【Ｊ］．中国食 阶段，仍不能广泛应用于实践。这就需要国内外研究 品卫生，２００６，１８（３）：２０５—２０９． 者进一步加快研究步伐、不断完善和改进现有检测技 ［２Ｏ】Ｗａｎｇ Ｘ Ｗ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，］ｉｎ Ｌ Ｑ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ 术，以期建立更灵敏、更有效、更简便、更实用的食品 ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｅｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｆｏｄ－ｂｏｍｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ［Ｊ］：Ａｐｐ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．Ｂｉｏｔｏｃｈｎｏ１．， 病原微生物快速检测技术。 ２００７，７６（１）：２２５—２３３． ［２ １】Ｃｈｉｚｈｉｋｏｖ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａ ｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ［参考文献］ ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｏｒｎ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏ１．，２００１，６７：３２５８—３２６５． 【１）张晓华，等．中国对虾弧菌病的间接荧光抗体诊断技术研究［Ｊ］＿ 【２２３ Ｓｏｎｇ Ｔ，Ｔｏｍａ Ｃ，Ｎａｋａｓｏｎｅ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ 海洋与湖沼，１９９７，４（４）：４９—５３． ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｉｇｅｌｌａ ａｎｄ ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｙ （２］Ｃｒｙａｎ Ｂ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ［】］．ＦＥＭＳ ｅｎｔｅｒｏ—ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｈｅａｔ—ｓｔａｂｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００５，２４３：２５９—２６３． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，２８（４）：７９２—７９４． ［２３】黄帆，李琳，林世平，等．ＤＮＡ环介导恒温扩增技术快速检测 【３）葛萃萃，钟青萍，张旺，等．双抗夹心ＥＬＩＳＡ检测食品中大肠 结核分枝杆菌的研究【Ｊ］．现代食品科技，２００８，２４（８）：８３５— 杆菌Ｏ１５７：Ｈ７方法研究［Ｊ］．食品科学，２００７，２８（１）：１７１． ８３８． ［４］杨静，焦新安，文其乙，等．沙门氏菌属特异性单克隆抗体在快 ［２４］周向华，王衍彬，叶兴乾，等．电阻抗法在食品微生物快速检测 速检测中的应用［Ｊ】．中国卫生检验杂志，１９９７，７（３）：１３６一 中的应用［Ｊ］．粮油加工与食品机械，２００３（１０）：７３—７５． ｌ３９． ［２５】Ｐｌｅｓｓ Ｐ，Ｆｕｔｓｃｈｉｋ Ｋ，ＳｃｈｏｐｆＥ．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ ｂｙ 【５］窦勇，宁喜斌．副溶血弧菌间接ＥＬＩＳＡ快速检测法的建立［Ｊ］． ｍｅａｎｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｉｍｐｅｄａｎｃｅ ｓｐｌｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ 食品工业科技，２００７，２８（６）：２０５—２０９． Ｐｏｒｔｅｃｔｉｏｎ，１９９４．５７（５）：３６９—３７６．・ ［６］王忠民．免疫层析技术研究进展［Ｊ］．国外医学临床生物化学与 ［２６］减改华，苗秋丽，王淑英．应用放射测量法对大肠杆菌的定量 检验学分册，２００１，２２（２）：９６—９７． 检测Ｌ刀．河南预防医学杂志，１９９４，５（３）：ｌ４９—１５０． ［７］罗立新，缪珑，潘力，等．快速检测产单核李斯特菌免疫胶体金 ［２７）代娟，李玉峰，杨潇．食品微生物快速检测技术研究进展 ．食 层析法的研究踟．中国卫生检验杂志，２００６，１６（２）：１５４—１５６． 品研究与开发，２００６，２７（５）：ｌｌＯ—ｌ１２． ［８】Ｓ ｅｒｖｅ Ｅ，Ｏｌｓｖｉｋ Ｏ．Ｉｎｕｎｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ［２８ｌ祝松，何进，喻子牛．毛细管电泳在细菌分离分析中的应用［Ｊ】． ｆｒｏｍｆｏｏｄｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ．Ｊ．ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏ１．，１９９１，１４（１）：１ｌ一１７． 微生物学通报，２００５，３２（３）：１２５—１２８．
