药学进展试题(备答案)

1.简述酶降解型结肠给药系统的结肠定位释药原理。 结肠定位释药系统 h(3ko An

定义：结肠定位释药系统是近年来研究较多的定位释药制剂。升结肠和大部分横结肠只有口服途径能接触到，直肠给药很少能把药物运送到结肠，它对于结肠疾病的治疗，增加药物的全胃肠道吸收有很重要的意义。结肠特点在药物吸收方面具有重要意义:①对于离子型药物,膜两侧的电位差是吸收的主要动力。②结肠壁对大分子的屏障作用比小肠处小,因此有利于蛋白多肽类的吸收。③大量水分在结肠处吸收,有利于药物通过溶剂牵引方式被吸收。④结肠上皮对表面活剂较为敏感,故可通过添加吸收促进剂的方法促进大分子药物吸收。 kESnlmy@J

优点：(1)有些药物容易被胃酸破坏或者被胰酶代谢而失去治疗作用，而药物在结肠就不受这些影响，把这些药物制成结肠靶向给药系统可以增加其生物利用度；(2)蛋白多肽类药物往往在上消化道中被酶降解，使口服给药遇到很大困难，而大肠中蛋白水解酶含量很低，把药物运送到大肠部释放，可以解决酶屏障问题，而且发现多肽类药物在小肠末端的吸收很好，结肠靶向给药系统有望解决多肽类药物的生理屏障问题；(3)在夜间发作的哮喘、心绞痛、关节炎等疾病的治疗中，药物在结肠缓慢释放，将发挥长效作用；(4)治疗结肠疾病如

溃疡结肠炎、出血结肠炎、Crohn症，药物在病变区直接释放将更有效；(5)治疗结肠直肠癌的靶向给药系统，可以提高局部药物浓度，从而提高疗效，还可以减少化疗药物对胃肠道的刺激，减少由于胃肠道吸收所引起的全身毒副作用；(6)杀肠虫药和结肠诊断试剂的结肠靶向释放可以减少剂量和副作用。 qQx5n

类型：把药物运送到结肠部的保护包衣；具有延时作用的缓释制剂；使用生物降解材料，在结肠部被结肠特有的微生物酶分解，从而释放出药物；结肠靶向粘附释药系统。 原理： 1 ：pH 依赖型释药系统 一般消化道内的pH 为0. 1 9 ～1 .1 5,小肠为6 .1 0 ～6. 1 8,在结肠为6. 1 5 ～7. 1 5 。所以口服结肠定位的体外研究方法一般以0. 1 mo l /HCL 模拟OCDDS 在胃中的情况, pH6. 1 8 磷酸盐缓冲液模拟OCDDS 在小肠的情况, pH7. 1 2 磷酸盐缓冲液模拟OCDDS 在结肠的情况。丙烯酸树脂在pH> 7 1 0 的环境中溶解引起药物释放,所以丙烯酸树脂可以作为OCDDS 的载体材料。 根据胃肠道pH变化，用肠溶材料包衣，使药物在胃和小肠中不释放，在小肠末端和结肠中，当pH接近7时，包衣材料溶解而释放出药物。甲基丙烯酸共聚物、羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯、邻苯二甲酸醋酸纤维素等均可用作肠溶材料。不过也有文献指出，由于胃肠中，pH并非连续增加，所以肠溶材料包衣法的靶向特异不强。 $mq @g

2.缓释制剂法 这种方法的理论根据是小肠具有相对恒定的转运时间，药物从胃中进入小肠后，一般经过3h～4h到达结肠部。设计结肠靶向缓释制剂时要考虑3点：使药物在胃中不释放；具有一定滞后时相；活药物在结肠部迅速释放。这种结肠靶向给药系统也被称为按预定方案定位释放的给药系统(Time-based positioning drug delivery systems)。2.1 难溶材料包衣：用难溶材料包衣制备缓释制剂，使药物释放变得困难，药物在到达结肠才开始释放，从而实现靶向给药的目的，Muraoka M等用水不溶材料乙基纤维素(EC)的明胶胶囊内层包上一层厚度为40μm的衣膜，制备压力控制结肠靶向胶囊。 2.2 难溶材料骨架片：果胶(Pectin)有一定的水溶，但经过高度甲氧基化或制成钙盐之后，水溶大大降低。Rubinstein等用果胶钙制备吲哚美辛(Indomethacin)骨架片，体外释放试验表明，在膜拟的胃和小肠条件下没有药物释放，在加入结肠细菌的介质中，果胶被分解释放出药物。 硫酸软骨素(Chondroitin)与1，12-二氨基十二烷的交联聚合物水溶降低，其特殊的理化质被用于结肠靶向给药的载体。 v'H\\KR-;

3 . 菌群触发型释药系统 它是利用结肠菌群产生的酶作用于包裹材料而引起药物释放的,因此,这一给药系统具有更强的靶向。这一类靶向材料最近几年结肠给药的一个研究热点,已开发及合成出十几种靶向定位材料。 QpC,komLJ

3.1 偶氮聚合物(Azo polymers)：偶氮聚合物只于结肠细菌偶氮分解酶的作用下才能分解，因此是结肠靶向给药系统的适宜材料，最近发展得很快。Cheng CL等用偶氨聚合物包衣胶囊作为蛋白多肽类药物的结肠靶向载体，用Vit B12作为模型药物进行体外释放研究，结果表明，释放取决于偶氮聚合物的溶胀度，而溶胀度随pH增加而增加。Ｓａｆｆｒａｎ等[13]合成了一种聚苯乙烯和羟乙基异丁烯酸交联而成的高分子化合物,将它作为衣层制成胰岛素和加压素胶囊及小丸。,Ｍｏｏｔｅｒ合成了羟乙基异丁烯酸(ＨＥＭＡ)、甲基异丁烯酸(ＭＭＡ)、ＨＥＭＡ与ＭＭＡ的四聚物及异丁烯酸(ＭＡ)构成的复聚物,以其作为胶囊的包衣材料。 Van den Mooter G等报道，偶氮苯与丙烯酸树脂共聚物的释放效果更好，布洛芬(Ibuprofen)的这种共聚物包衣胶囊在释放介质中19h释放了98.7±1.1)%，而没有丙烯酸树脂的偶氮合物包衣胶囊只释放了(26.2±4.9)%。 ohj(1jt

3.2 多糖类(Polysaccharides)：多糖类作为药物载体已经有多年的应用了，其具有不可比拟的优越:①在消化道上部(胃、小肠内)通常不被吸收,而能被结肠细菌专一降解。②作为天然化合物,不仅价廉易得,而且其安全已经长期使用证实并多已被作为药用辅料收载入各国药典。但这类化合物往往是水溶大分子。因此需要对其结构进行改造或形成衍生物,在不削弱其靶向的前提下,提高疏水,以便更有效地保护药物。这类化合

物主要有:直链淀粉、葡聚糖、果胶、瓜耳豆胶、硫酸软骨素等。直链淀粉是淀粉的主要组成成分。它可在一定条件下胶化形成衣层。这一衣层可抵御胰α 淀粉酶的作用,能被结肠细菌产生的淀粉酶降解。Ｍｉｌｏｊｅ ｖｉｃ等[15]研究了用直链淀粉包衣的微丸的结肠定位。为克服直链淀粉在胃肠液中膨胀的缺点,他们在包衣液内加入了水不溶的乙基纤维素。壳聚糖是一种氨基多糖,是由广泛存在于海洋生物的甲壳中甲壳质脱乙酰化的产物,近年来作为一种缓控释材料得到广泛应用。壳聚糖具有很好的生物相容,其分子中的糖苷键亦能为结肠酶降解,故而也可作为结肠靶向材料。壳聚糖易溶于酸,而对碱环境有较强的抵抗力。有人用戊二醛为交联剂制成交联壳聚糖,可减小其在酸中的溶解度。以肠溶衣包裹的壳聚糖含药小球可以保护药物安全通过胃和小肠,到达结肠后,随衣层溶解,壳聚糖被酶降解,药物随之释放出来。瓜尔豆胶是另一种可被结肠菌群降解的多糖。但因其亲水和膨胀过大致使药物在小肠即开始释放。为提高其疏水,采用瓜尔豆胶与丙烯酸树脂的混合物对片剂进行包衣[20]。采用这葡聚糖(Dextran)和壳聚糖(Chitosan)均可以在结肠细菌酶的作用下分解，而在胃和小肠中不容易水解，是结肠靶向给药系统的适宜材料。 Lorenzo-Lamosa ML等发现把壳聚糖和丙烯酸树脂结合使用，能更好地控制药物在结肠中的释放。 [W{WfJ-HwG

3.3 环糊精(Cyclodextrins)：环糊精在结肠微生物发酵作用下被分解为寡糖，却不容易被水解，因此不会在胃和小肠中释放药物，可以用于制备结肠靶向药系统。Uekama K等用环糊精制备前体药物，阐明了其释放机理：环糊精在盲肠和结肠部被分解开环，接着酯键被水解，药物释放出来。 mhZ60RW

4 结肠靶向粘附释药系统 结肠靶向粘附释药系统把药物运送到结肠部，释放出含药微粒，并使含药微粒在一定时间内粘附在结肠粘膜表面，延长药物作用时间，并能承受消化道内容物转运推动力，药物直接扩散到结肠粘膜细胞而吸收，没有从内容物中扩散出来的过程，因此释放和吸收更完全、更精确。2.4.1 非特异载体 目前用于研制生物黏附的载体有海藻酸盐、纤维素衍生物、葡聚糖、明胶、果胶、壳多糖等,而其中以卡波姆类的研究最为广泛。2.4.2 特异载体 1抗原抗体反应;2N-(2-羟丙基)甲基丙烯胺共聚物;3外源凝集素(植物血凝素);4微粒:如脂质体、微囊、微球、毫微粒等。 ~99DE78 %qj8*1

2.简述高效毛细管电泳常用的分离模式及其在药物分析中的应用。 八

分离模式,介绍常用的几种;

根据试样性质不同,采用不同的分离类型;

每种机理的选择性不同;

,毛细管区带电泳

capillary zone electrophoresis ,CZE

带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和. 正离子:两种效应的运动方向一致,在负极最先流出;
中性粒子:无电泳现象,受电渗流影响,在阳离子后流出; 阴离子:两种效应的运动方向相反;ν电渗流 >ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在

种情况下,不但可以按类分

离,同种类离子由于差速迁移被相互分离. 最基本,应用广的分离模式; 二,毛细管凝胶电泳

capillary gel electrophoresis ,CGE

将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶. 其具有

孔性,类似分子筛的作用,试样分子按

小分离.能

够有效减小组分扩散,所得峰型尖锐,分离效率高.

蛋白质,DNA等的电荷/质量比与分子大小无关,CZE模式很难分离,采用CGE能获得良好分离,DAN排序的重要手段. 特点:抗对流性好,散热性好,分离度极高.

无胶筛分技术:采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺.柱便宜,易制备.

三, 胶束电动毛细管色谱(MECC ,MEKC)

1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂,其浓度达到临界浓度,

形成一疏水内核,外部带负电的胶束. 在电场力的作用下,胶束在柱中移动.

2. 电泳流和电渗流的方向相反,且ν电渗流 > ν电泳 ,负电胶束以较慢的速度向负极移动;

3.中性分子在胶束相和溶液(水相)间分配,疏水性强的组分与胶束结合的较牢,流出时间长;

4.可用来分离中性物质,扩展了高效毛细管电泳的应用范围; 四,毛细管等电聚焦

1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术; 2. 毛细管内充有两性电解质(合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物),当施加直流电压(6～8V)时,管内将建立一

由阳极到阴极逐步升高的pH梯度;

3. 氨基酸,蛋白质,多肽等的所带电荷与溶液pH有关,在酸性溶液中带正电荷,反之带负电荷.在其等电点时,呈电中性,淌度

零;

4. 聚焦:具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移,分别到达满足其等电点pH的位置时,呈电中性,停止移动,形成窄溶质带而相互分离;

5. 阳极端装稀磷酸溶液,阴极端装稀NaOH溶液; 6. 加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测; 7. 电渗流在CIEF中不利,应消除或减小. 五,毛细管等速电泳

1. 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为导离子(充满

毛细管)和尾随离子,试样离子的淌度全部位于两者之间,并以同一速度移动.

2. 负离子分析时,前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的.所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进,逐渐形成各自的区带而分离.阴极进样,阳极检测.

3. 不同离子的淌度不同,所形成区带的电场强度不同(ν=μE),淌度大的离子区带电场强度小;

沿出口到进口,将不同区带依次排序1,2,3,4 电场强度依次增大.假设\"2\"号中离子扩散到\"3\"号,该区电场强度大,离子被加速,返回到\"2\"区;当\"2\"号中离子跑到\"1\"号区,离子被减速使之归队;

4. 特点:界面明显,富集,浓缩作用; 六,毛细管电渗色谱

在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液,以电渗流为流动相,试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程

药物分析中的应用

HPCE在中药分析中的应用中药的有效成分种类繁多，HPCE首先应用于生物碱、黄酮苷类成分的分析，继而推广到香豆素类、强心苷、皂苷类、有机酚酸类等非挥发性成分的分析。本文从中药材有效成分分析和中药制剂成分分析两

方面来进行归纳总结。

2.1 中药材有效成分的分析 中药材的有效成分多为生物碱类、黄酮类、有机酸类、香豆素类及各种苷类，这些成分都可以用HPCE法进行分析。已经研究过的中药材有麻黄、黄连、黄柏、黄芩、芍药、大黄、甘草、柴胡、厚朴、当归、马钱子、丹参、吴茱萸等。

2.1.1 生物碱类 生物碱类成分能解离带上正电荷，一般用CZE模式分析。Liu等和朱萱萱等建立了测定麻黄中6种生物碱：麻黄碱、伪麻黄碱、去甲麻黄碱、去甲伪麻黄碱、甲基麻黄碱、甲基伪麻黄碱的CZE方法。对不同品种麻黄中生物碱的含量和麻黄炮制方法进行研究，结果表明草麻黄中总生物碱含量较高，经闷润法炮制后总生物碱的得率最高。Liu等还分析了黄连中的黄连碱、小檗碱、表小檗碱、巴马汀、非洲防己胺、药根碱、5-羟基小檗碱、木兰花碱等，13min内可将上述8种生物碱完全分离。张国华等用均匀设计法优化小檗碱、巴马汀、药根碱的分离条件，最优分析条件是：60 mmol.L-1磷酸氢二钠(pH 7.0)-35%甲醇，14 kV电压，30℃，分析时间6 min。以0.5 mol.L-1醋酸钠(pH4.6)-50%乙腈为电解液，9min内可分离黄柏中的6种生物碱：小檗碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱、黄柏碱和小檗红碱。用此法分析市售的31种黄柏药材，发现威氏黄柏和日本黄柏中小檗碱含量约占总生物碱量的80%，而在关黄柏和川黄柏中仅为40%。为联

用质谱(MS)以提高方法的灵敏度，Henion等以可挥发的醋酸铵(60mmol.L-1)与40%的甲醇组成电解液测定黄柏中的9种生物碱，当信噪比为3时检测限达9×10-6～1.3×10-15mol。Akada等建立的CZE方法也能分离黄连和黄柏中的黄连碱、小檗碱和巴马汀。

林梅等分离了4种莨菪类生物碱，即阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱和樟柳碱，并考察了在磷酸盐缓冲液中加入不同有机溶剂(甲醇、乙腈、四氢呋喃)对分离选择性的影响。生马钱子有剧毒，必须炮制后才能药用，Zong等以CZE测定了炮制前后马钱子中士的宁和马钱子碱的含量，结果表明炮制后2种生物碱的含量下降约90%，所以药性变得温和。长春花叶子中的长春新碱和长春碱的结构和pKa值都十分接近，需要较高浓度(0.2mol.L-1)的醋酸铵缓冲液才能分离。Stuppner等分析了绒毛钩藤根皮、花菱草和白屈菜中主要生物碱，外标法定量。分离白屈菜中生物碱时，缓冲液中加入了12.5m mol.L-1β-环糊精(β-CD)，它能与待测物形成包合物，提高了分析的选择性。Zhang等分离了甜菜中的生物碱类成分，样品需柱前衍生化，电解液为50m mol.L-1磷酸盐缓冲液(pH3.5)。用MECC可同时分离吴茱萸碱、吴茱萸次碱和去氢吴茱萸碱等9种生物碱类成分，但去氢吴茱萸碱的峰拖尾严重；改以CZE分析去氢吴茱萸碱，柱效能达到1.×105塔板，拖尾因子为1.19，基本满足定量的要求。Sun等研究9种

阿朴啉类生物碱的分离，由于它们结构十分相似，采用MECC模式，分析时间仅9min，与HPLC比约缩短一半。 罂粟壳和鸦片中的生物碱主要为吗啡、可待因、罂粟碱、去甲基吗啡、二甲基吗啡、诺司咳平等，目前已有用CZE、MECC和NACE等测定此类成分含量的报道。其中NACE为首次报道，文中考察了乙腈、甲醇、甲酰胺、N-甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲亚砜、二甲基甲酰胺等作为电解液溶剂的可能性。6种生物碱在乙腈、甲醇、甲酰胺和N-甲基甲酰胺作溶剂的条件下能完全分离，但在甲醇、甲酰胺和N-甲基甲酰胺FA和NMF中峰高明显下降，进一步考察乙腈-甲醇混合比对分离选择性的影响，1∶3为最优。

Unger等将场放大技术(Field Amplified Sample Injection,FASI)用于生物碱的分析，具体做法是在电迁移进样(16 kV，8s)之前进以一小段70%甲醇。实验得到的灵敏度(LOD)比流体动力学进样1s高1000倍。他们建立的CZE方法适用于吲哚类生物碱及生物胺、原小檗类生物碱、β-咔啉类生物碱和鸦片中异喹唑啉类生物碱的分离，选用的电解液为：100m mol.L-1醋酸铵(用醋酸调pH至3.1)-50%乙腈。 2.1.2 黄酮类 黄酮类化合物有很多重要的生理活性，广泛存在于植物中，多用MECC模式分离。Aramendia等和Shihabi等以CZE分离了5种异黄酮。Liu等以MECC分离了黄芩中的黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素(Wogonin,W)、汉黄芩

素-7-O-葡糖苷酸(WG)、木蝴蝶素A(oroxylin A,O)和木蝴蝶素A-7-O-葡糖苷酸(OG)。Morin等研究了糖基不同的槲皮素糖苷的CZE分离，还比较了香叶木素、香叶木苷、香叶木素-7-O-葡糖苷、橙皮素、橙皮苷、蒙花苷(linarin)、异野漆树苷(isorhoifolin)等的CZE和MECC分离，认为黄酮苷能与硼砂形成带负电的络合物，依络合程度不同而达到分离，不含硼砂的电解液对黄酮苷无分离能力。Pietta等分离了洋接骨木花、金盏花、山金车花、银杏叶等中药中的芦丁、槲皮素、异槲皮素、山奈素等多种黄酮苷和苷元。他们还以pH 8.5的硼砂-SDS缓冲液分离了心叶椴和阔叶椴叶子中的8种黄酮苷。Liang等对淫羊藿中的黄酮类化合物的分析进行了研究，以20 m mol.L-1硼砂-48 m mol.L-1SDS-1 m mol.L-11，3-二氨基丙烷(pH 8.5)为电解液，20min内14种黄酮苷能完全分离，但淫羊藿苷(icariin)、淫羊藿糖苷B(epimedin B)和淫羊藿糖苷C(epimedin C)的峰部分重叠。根据它们的pKa值(均在10.7左右)，当电解液为30 mmol.L-1硼砂-12 m mol.L-1SDS(pH 10.45)时能完全分离，以胆酸盐(35 mmol.L-1)或十六烷基三甲基溴化铵(40 mmol.L-1)作为表面活性剂，都能分离十字花科植物中的12种黄酮类化合物。

2.1.3 蒽醌类 此类化合物结构中多有羟基和羧基，用CZE和MECC都能分析。宗玉英等将25mmol.L-13-环己氨基-1-丙烷磺酸与25 mmol.L-1SDS-乙腈(100∶10)混合作为电解

液(pH 10.96)可分离大黄中5种蒽醌类化合物，并测定掌叶大黄、唐古特大黄和藏边大黄中的芦荟大黄素、大黄素和大黄酸。Stuppner等以CZE分离测定了狭叶番泻叶和尖叶番泻叶中的番泻叶苷(sennoside)A、A1和B。

2.1.4 香豆素类 Ochocka等以CZE分离了野菊花中7种香豆素类化合物，包括7-甲氧基香豆素(herniarin)、香豆素、伞形花内酯(umbelliferone)、香豆酸(coumarinicacid)、4-羟基香豆素(4-hydroxycoumarin)、6，7-二羟基香豆素(aesculetin)和二氢香豆素(dihydrocoumarin)。Chen等以SDS为表面活性剂分析测定了独活中的9种香豆素类化合物，包括香豆素、伞形花内酯、补骨脂素(psoralen)、花椒毒素(xanthotoxin)、佛手柑茨烯(bergapten)、奥斯索(osthol)、哥伦比亚醇(columbianetin)、哥伦比亚醇乙酯(columbianetin acetate)和哥伦比亚内酯(columbianadin)。

2.1.5 酚酸类 酚酸类成分解离后带负电荷，以CZE模式分析时在中性成分后出峰，分析时间较长。Jen等分离了14种酚酸类化合物。Chou等测定了厚朴中的和厚朴酚及厚朴酚的含量，最低检测限分别为0.2ng和0.5 ng。Kenndler等以0.1mol.L-1硼砂溶液(pH 9.5)为电解液，分离熊果叶中的熊果酸、间苯二酚、氢醌和没食子酸。张凤云等测定了氯原酸的含量。Wojiechowski等研究了欧地笋的活性成分的代谢情况，测定了木犀草素(luteolin)、木犀草素-7-葡糖苷

(luteolin-7-glycoside)、迷迭香酸(rosmarinic acid)、原儿茶醛、咖啡酸等成分。Liu等在电解液中加入阳离子表面活性剂十二烷基三甲基氯化铵(LTAC)，使EOF的方向翻转(指向正极)，出峰顺序为负离子、中性分子、正离子，这样酚酸类成分的分析时间就大大缩短了。Boyce等在硼砂-磷酸盐缓冲液(pH 8.5)中加入100 mmol.L-1SDS，能同时分离21种酚酸类成分和香豆素类成分。CITP模式可用于酚酸类成分的分析。Seitz等以pH 9.5的15 m mol.L-1盐酸-30%甲醇-0.2%羟丙基甲基纤维素(HPMC)为前导电解液，pH 10.6的10 mmol.L-1甘氨酸-氢氧化钡-30%甲醇-0.2%HPMC为终末电解液，分析了咖啡酸、木犀草素、阿魏酸(ferulicacid)、氯原酸等酚酸类成分。沈红梅等以CITP测定了乌梅中柠檬酸(citricacid)和苹果酸(malicacid)的含量。

2.1.6 苷类及其它成分 Iwagami等分离了7种人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg等。Hsieh等在硼砂缓冲液(pH 10.0)中加入30 m mol.L-1SDS和10 m mol.L-1γ-CD，成功地分离了5种柴胡皂苷a、d、c、b1、b2等。Honda等以CZE分离了芍药中的芍药苷、氧化芍药苷(oxypaeoniflorin,OPF)、甲基没食子酸盐、鞣酸和没食子酸。Wu等结合CZE和MECC(以胆酸钠为表面活性剂)分离了芍药中的伪麻黄碱、OPF、苯甲酸、丹皮酚、五倍酰葡萄糖(pentagalloylglucose,PG)、没食子酸、苯芍药苷

(bezoylpaeoniflorin，BAF)、白花素(albiflorin,AF)等成分。在pH9.3的硼砂-SDS缓冲液中加入7 mol.L-1脲或25 mmol.L-1胆酸钠都能分离毛花洋地黄中的强心苷类成分。Stuppner等以CZE分离了甜菜中的甜菜苷(betanin)、异甜菜苷(isobetanin)及苷元。Mauri等用MECC-MS分析了3种二萜糖苷(diterpene glycoside)，电解液为20 m mol.L-1硼砂-30 mmol.L-1SDS(pH 8.3)。Oehrle以25m mol.L磷酸盐-90 m mol.L-1SDS为电解液，成功地分离了银杏叶提取物中的白果内酯(biobalide)、银杏内酯A(ginkolideA)和银杏内酯B(ginkolide B)，分析时间18min。Hu等分离了紫丹参中的3种二萜醌类成分，即隐丹参酮(cryptotanshinone)、二氢丹参酮Ⅰ(dihydrotanshinoneⅠ)和丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA)。将多糖水解成单糖再衍生化后，以pH10.5的硼砂缓冲液为电解液可以测定洋甘菊和药蜀葵根中的糖类成分。紫杉醇(taxol，T)是一种二萜胺，具有抗癌作用，主要由红豆杉科植物的树皮中提取，Chan等以T、cephalomannine(C)和浆果赤霉素(baccatinⅢ，B)为指标，考察了松针替代树皮作为紫杉醇来源的可能性。王九一等以峰高定量测定紫杉醇样品含量，最低检测限为20μg.mL-1。鬼臼毒素(podophyllotoxin，P)和4′-去甲基鬼臼毒素(4′-desmethylpodophyllotoxin，DP)属木脂素类化合物，具有抗癌活性，以pH9.7的15 m mol.L-1磷酸氢二钠-50 m mol.L-1SDS-30%甲醇为电解液仅能使P和DP部分分离。

Davis等对麦瓶草属植物中的脱皮素类(ecdysteroids)成分进行了分析。

2.2 中药复方制剂的成分分析 中药复方制剂由多种药材组成，成分十分复杂。目前控制其质量的方法是测定其中一种或多种主要活性成分的含量，常用的分析手段是HPLC。在HPCE成功地用于中药材成分分析以后，很多分析工作者对多种成分的同时测定进行了深入研究。

的Liu等以CZE测定19种含麻黄的中药制剂(小青龙汤、大青龙汤、清脾汤、麻黄汤等)中的麻黄碱和伪麻黄碱的含量，分析时间仅3min，回收率98.0%～102.3%；以0.2mol.L-1醋酸钠-50%乙腈为电解液测定23种黄连或黄柏制剂(黄连汤、清胃汤、芍药汤、排毒散、白头翁汤等)中的黄连碱、小檗碱和巴马汀的含量，回收率98.0%～101.9%；以CZE测定甘草及开胃芍药散、桂皮汤、排毒散等中甘草酸和甘草次酸含量，回收率为98.1%～101.4%；还测定了5种中药制剂中甘草酸和肉桂酸的含量；用反向EOF-CZE方法分离当归散中的烟酸、阿魏酸和苯二甲酸，仅需3min。对于中药制剂来说应用得更多的是MECC模式。Liu等以MECC成功地分离了柴芩汤、小柴胡汤、三黄泻心汤、芍药汤等汤剂中的黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩素-7-O-葡糖苷酸。Lu等测定了13种中药复方中的苦杏仁苷(amygdalin)及普济消毒饮中的6种黄酮苷和4种生物碱类成分。他们还测定了大黄及

制剂中的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、番泻叶苷A和B等成分。Sheu等对中药制剂中多种有效成分的同时测定进行了深入研究，测定了小承气汤(大黄、枳实、厚朴)中的柚皮苷、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、番泻叶苷A和B，以及三黄泻心汤(黄连、黄芩、大黄)中的小檗碱、巴马汀、黄芩苷、大黄素、番泻叶苷A和B；对I-tzu-tang(升麻、柴胡、甘草、黄芩、大黄、当归)中的大黄素、芦荟大黄素、番泻叶苷A和B、黄芩苷、黄芩素、OG、WG、W、阿魏酸、咖啡酸、甘草酸等12种活性成分进行分析，运行时间仅14min；结合CZE和MECC分析测定了变通丸和甘露散(黄连、吴茱萸)中的7种黄连生物碱、4种吴茱萸生物碱和6种喹诺酮类生物碱。Huang等测定了桂枝汤(桂枝、白芍、甘草、干姜、大枣)中肉桂醛(cinnamaldehyde)、肉桂酸、芍药苷、甘草酸和［6］-姜辣素(［6］-gingerol)等成分的含量，还测定了柴胡散和小柴胡汤中5种柴胡皂苷的含量。Iwagami等测定了葛根汤等6种制剂中的甘草酸，以及加味逍遥散等4种中成药中的甘草酸和芍药苷。Kang等以CZE测定了中药制剂中的小檗碱、肉桂酸和甘草酸。张国华等也以CZE测定了香连丸、二妙丸、白带丸、牛黄上清丸、黄连上清丸、朱砂安神丸等成药中的小檗碱、巴马汀、药根碱等成分的含量。

3.建立中药指纹图谱的原则是什么？与化学药品质量控制方法相比较，中药指纹图谱技术有什么特点和优势？

建立指纹图谱的原则

中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。唯此，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。

1.系统性 是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。

2.特征性 是指指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有许多未知类成分，这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区别其来源、产地，判别药材的真伪优劣。

3.稳定性 是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。因而

要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。 特点

中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。

优势：（1）专属性强。指所制订的指纹图谱应该是该 药材所独有的、能与其它药材相区别的，其反映的化学信息是具有高度的选择性的；（2）稳定性好。即中药材的指纹图谱应该是从某中药材的多批次中归纳出的共性，图谱中的共有峰或特征峰应相对稳定；（3）重现性好。所制订的指纹图谱在规定条件下应能再现指纹特征（如共有峰数目、大小、位置等），其误差应在允许的范围内。只有这样，所制订的指纹图谱才具有实用价值。

4.简述手性药物进入体内拆分和分析的必要性。

利用化学拆分法、超临界流体色谱法、膜法、酶法以及模拟流动床法分离药物对映体 1 化学法

化学拆分法是广泛使用的一种方法，经典的化学拆分是利用手性试剂与外消旋体反应，生成两个非对映异构体，再

利用其物理性质的差异将其拆分。但此类方法存在收率较低、拆分剂消耗大及在拆分的化合物类型上受到等缺点。近几年来，随着主客体化学的深入研究而发展起来的包结拆分(inclusion resolution)由于其拆分效率高、操作简单及适用条件广泛等优点而受到重视。

包结拆分的基本原理是：手性主体化合物通过氢键及分子间的次级作用，选择地与客体分子中一个对映体形成稳定的包结络合物析出来，从而实现对映体的分离，由于包结拆分中主体分子与客体分子间不发生任何化学反应，只是通过分子间作用力来实现拆分，因而很容易地通过如柱、溶剂交换以及逐级蒸馏等手段与客体分离和可循环使。甾类化合物是最优良的包结主体之一，因为其化学结构中富含多种功能基且刚性很强，其中胆汁酸类衍生物广泛地应用于手性醇、酮及手性亚砜类化合物的拆分。

Hisakazu等利用一种酒石酸衍生物作为包结主体拆分了外消旋的甲基取代环丙烯等一系列化合物，经蒸馏后，得到光学纯度为28%~75%的包结络合物。 2 超临界流体色谱法(SFC)

超临界流体色谱具有简单、高效、易于变换操作条件等优点，已成为和高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)互为补充的拆分方法，因其具有独特的优越性，应用前景极为广阔。Petersson对1993年以前SFC在手性化合物分离上的应用作

了综述［5］，李桦等总结了SFC在手性药物拆分中的优越性［6］。

根据手性选择剂种类不同，SFC分离方式主要包括［7］氨基酸和酰胺类手性固定相、Prikle型手性固定相、环糊精型键合固定相、多糖型的手性固定相以及其他手性固定相如聚甲基异丁烯酯等。但是SFC正处于迅速发展阶段，各种参数(如温度、压力、流动相的组成和密度等)对分离度的影响机制还未完全清楚。人们可借鉴HPLC、GC、HPCE手性分离的经验和成果，研制出各种类型的适合SFC分析的手性固定相及操作条件。

最近，Nozal［7］等用Chiralpak AD柱和Chiralcel OD柱在SFC条件下拆分了驱肠蠕虫药阿苯哒唑亚砜化合物(图5)，并研究了甲醇、乙醇、2丙醇及乙腈等有机溶剂对立体选择型的影响。结果表明，在以Chiralpak AD柱为固定相时，用2丙醇可以获得最好的拆分效果；而在Chiralcel OD柱上用甲醇效果最好。 3 膜分离法

氨基酸的生物转移通常是由埋在生物膜中的载体蛋白来传递的，这种转移的对映体选择性是非常高的。很久以来，人们就希望将这种对映体转移体系用于分离技术中，通过膜分离进行旋光异构体的拆分正是这种生物过程的模拟。 3.1 液膜分离法

1979年D.J.cram等首先报道了一种膜分析方法。在这种液膜体系中，手性分子(主体)与外消旋(客体)结合，通过氯仿载其从一水溶液至另一水溶液再释放出来。这种装置能够同时连续地将外消旋体拆分为两个对映体，得到旋光纯度为70%~90%。另外，一种氨基酸光学拆分液体膜在光学活性冠醚中浸入聚合薄膜的形式而得以制备［8］。手性冠醚(图6A)通过液体膜可作为氨基酸及胺类对映体选择性的中间媒介，几乎所有的氨基酸都可通过它们的对映体形式分离，其中大空间位阻基团的氨基酸会有较高的光学拆分率。 3.2 手性固定膜

近年来，对映体膜分离的另一个新发展是手性固体膜的发展［9］。Maruryama等认为，物质通过膜的渗透是由被拆分物质早膜中的分配行为和他们在膜中的扩散速度来决定的。为了提高膜的对映体选择性，需要优化这两个因素。据此他们制备了有两亲性侧链的α螺旋链聚氨基酸衍生物，作为手性膜材料，成功拆分了酪氨酸和色氨酸，D，L对映体的渗透比率大于8.0，经过500 h的渗透，选择性没有下降。纤维素衍生物固体膜在手性拆分中的应用也较多。尤其是纤维素三(3.5二甲基苯基氨甲酸酯，CTPC)(图6B)膜表现出极好的手性选择性。

Jang［10］等最近用海藻酸钠(SA，图6C)和脱乙酰壳多糖(CS，图6D)分别与戊二醛所生成的交联复合物作为膜材料，对外

消旋的色氨酸进行了拆分，光学纯度达98%以上。 4 模拟流动床色谱(SMB)法

模拟流动床色谱(simulated moving bed chromatography)技术是由D.B.Broughton在1961年的一个专利中提出来的。最初这种技术用于正己烷和环己烷的分离，后来又用于间二甲苯和对二甲苯的大规模制备。模拟流动床手性拆分系统在运行过程中，旋转阀间歇性地开关，控制在不同时间外消旋体的进样、新溶剂的注入和两个旋光异构体的提取位置。SMB的流程简图如图7所示［11］。

装置是由12根色谱柱串联，由一循环泵将最后一根柱子中的溶液泵回到第一根形成环路。将外消旋混合物在两根柱子之间加入，经一段时间后，保留时间小的组分在前面，保留时间长的组分在后面，在预定的时间和位置，分别将其取出小部分。因为流动相的运动和固定相是相对反向的，因此这种逆流色谱性质使得传质驱动力达到最大，这样就减小了洗脱剂的消耗量。

Nagamatsu［12］等用中等规模的SMB成功的拆分了奎尼丁甲羟戊酸酯(DOLE，图8)，所采用的是分析型Chiralcel OF柱，流动相为ψ(正己烷∶2丙醇)=8∶2，流速为1.0 mL/min。试验还通过计算机软件寻求最佳的操作条件，结果表明，较高的流速和较短的间歇时间可以提高对映体的拆分，其无论是从产率和溶剂消耗量上都优于液相色谱法。

5 酶法

应用酶和微生物在底物上引进手性中心的方法有很久的历史了，如氢化可的松及维生素C的生产等。因为酶的活性中心是一个不对称环境，有利于识别消旋体，在一定条件下，酶只能催化消旋体中的一个对映体发生反应而成为不同的化合物，从而使两个对映体分开，反应产物的对映过剩百分率可达100%。另外，酶催化的反应大多在温和的条件下进行，温度通常不超过0~50 ℃，pH值接近中性；而且酶无毒，易降解不会造成环境污染，适于大规模生产。因此，用催化效率高、专一性强的酶拆分消旋体是获取对映体纯化合物的捷径。随着酶固定化技术、多相反应器等新技术日趋成熟，大大促进了酶拆分技术的发展，脂肪酶、酯酶、蛋白酶、转氨酶等诸多酶类已用于外消旋体的拆分［13］。

脂肪酶(Lipase)是研究最早的一类酶，是一类特殊的酯键水解酶。脂肪酶具有高度的选择性和立体专一性，且反应条件温和，副反应少，适用于催化非水相介质中的化学反应。Michimasa［14］等分别用Pseudomonas sp脂肪酶和猪胰脂肪酶(PPL)对2苯1丙醇进行了拆分，反应是通过两种酶分别催化酯交换反应而进行，使得对映体拆分率分别提高到了39%和41%。

另外，酯酶具有很高的工业价值，其应用前景也极为广阔。最近，Jianxin［15］等利用Pseudomaonas cepacia脂肪

酶拆分了一类酰基取代的1环己烯衍生物。因为在抗体或抗肿瘤的天然活性物质中常含有此基团，是一类极有药用前途的母核。该方法通过酶催化酯交换反应，而得到了产率较高的光学纯化合物，且提供了反应过程监测方法，因此可有效的推广到该类化合物的一系列衍生物的合成与拆分，其主要反应如图9所示。图9 1-环己烯衍生物的拆分 Fig.9 The resolution of derivates of 1-hexene

随着科技的进步，酶法在实现手性药物的拆分和生物转化方面发挥着越来越大的作用，各种新的方法与技术正层出不穷，抗体酶、交联酶晶体、固定化酶及非水相酶学等都成为当今酶学研究的活跃领域，这些技术的发展与完善必将推进拆分技术的发展。

5.试阐述药物在体内的变化过程。 一、药物的跨膜转运

1、被动转运（顺梯度转运）：药物依赖于膜两侧的浓度差，从高浓度的一侧向低浓度的一侧扩散转运的过程。大多数药物属于被动转运。（1）特点：不需要载体，不消耗能量，无饱和现象和竞争性抑制。

（2）影扩散速度的因素：

①膜两侧的药物浓度差。

②药物的理化性质：分子量小、脂溶性大、极性小、非解离型的药物易通过生物膜转运，反之难跨膜转运。

2、主动转运：是一种逆浓度（或电位）差的转运。

特点：需要载体，消耗能量，有饱和现象和竞争性抑制。

二、吸收

吸收速度与程度主要取决于药物的理化性质、剂型、剂量和给药途径。

1、消化道吸收

（1）口腔粘膜：脂溶性药物如甘油（舌下给药）以简单扩散方式被吸收。

（2）胃：小的水溶性分子如酒精可自胃粘膜吸收。

（3）小肠、大肠：大多数药物在小肠被吸收。

（4）影响药物在胃和肠中吸收的因素：

①溶解度：多数药物以脂溶扩散的方式被吸收。

②PH：PH主要通过改变解离与非解离分子的比值而影响吸收。

弱酸性药物在酸性环境中非解离型多，脂溶性大，吸收多；但在碱性环境中，解离型多，脂溶性小，吸收小。

弱碱性药物在碱性环境中非解离型多，脂溶性大，吸收多；但在酸性环境中，解离型多，脂溶性小，吸收少。

（5）首过消除：某些药物通过肠粘膜及肝脏时经受药物代谢酶灭活代谢，进入体循环的药量减少。

三、分布

决定药物在体内分布的因素：

1、药物的理化性质：如分子大小，脂溶性。

2、药物与血浆蛋白的结合率：为可逆性疏松结合，结合型药物分子量增大，不能跨膜转运、代谢和排泄，并暂时失去药理活性，某些药物可在血浆蛋白结合部位上发生竞争排挤现象

3、药物与组织的亲和力，如碘在甲状腺中浓度比血浆高1万倍。

4、特殊屏障：

（1）血脑屏障：血液与脑细胞、血液与脑脊液、脑脊液与脑细胞之间的屏障。分子量小脂溶性高的药物易通过血脑屏障。

（2）胎盘屏障：某些药物可通过此屏障引起胎儿不良反应。

5、体液PH：如用碳酸氢钠碱化血液和尿，促进巴比妥类药物由脑细胞向血浆中转运和从尿排泄。

四、生物转化（代谢）

1、生物转化类型及其催化酶：

（1）生物转化类型：

①第一相反应：包括氧化、还原、水解，是母药加入极性基因如-OH，产物的多数是灭活的代谢物，但也有少数药物变为活性或毒性代谢物。

②第二相反应：结合反应，是母药或代谢物与内源性物质如葡萄糖醛酸和甘氨酸结合。结合的产物一般是极性高，水溶性大、药物活性减弱或消失。

（2）催化酶：

①专一性酶：如乙酰胆碱酯酶（AchE）、单胺氧化酶、它们分别转化Ach和单胺类药物。

②非专一性酶：肝微粒体混合功能氧化酶（肝药酶）。

组成：细胞色素P450，细胞色素b5和辅酶Ⅱ（NADPH）。

功能：促进多种药物和生理代谢物的生物转化。

2、肝药酶的诱导剂和抑制剂：

（1）诱导剂：如苯巴比妥钠和苯妥英钠，能诱导酶的活性，加速自身或其它药物的代谢，使药物效应减弱，如苯巴比妥长期应用后产生耐受性。

（2）抑制剂：如异烟肼和氯霉素，能抑制酶的活性，降低其它药物的代谢，使药物效应敏化。

五、排泄

1、肾排泄（主要排泄途径）：

（1）药物从肾小管中重吸收量与尿液PH有关。弱酸性药在酸性尿中非解离型多，易重吸收，排泄慢；在碱性尿中，解离型多，重吸收少，排泄快，如弱酸性巴比妥类中毒时，用碳酸氢钠以碱化尿液，促进排泄。

（2）同类药物之间有竞争性抑制排泄现象，如丙磺舒抑制青霉素自肾小管分泌。

2、胆汁排泄：

许多药物如洋地黄毒碱甙或其它代谢物从肝细胞经胆汁排入小肠中，结合型药物在肠中受细菌或酶的水解后可被重吸收，形成肝肠循环。

3、乳汁排泄：某些药物如吗啡经乳汁排泄，故哺乳期用药时应注意。

6.根据中国首个喹诺酮类新药安妥沙星成功上市，阐述其结构特点、临床疗效特点及喹诺酮的构效关系。 ｛此答案不全｝

临床疗效特点：盐酸安妥沙星片适用于敏感细菌所引起的下列轻、中度感染。呼吸系统感染：急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、弥漫性细支气管炎、支气管扩张合并感染、肺炎、扁桃体炎（扁桃体周围脓肿）；

泌尿系统感染：肾盂肾炎、复杂性尿路感染等；生殖系统感染：急性前列腺炎、急性附睾炎、宫腔感染、子宫附件炎、盆腔炎（疑有厌氧菌感染时可合用甲硝唑）；皮肤软组织感染：传染性脓疱病、蜂窝组织炎、淋巴管（结）炎、皮

下脓肿、肛周脓肿等；肠道感染：细菌性痢疾、感染性肠炎、沙门菌属肠炎、伤寒及副伤寒；败血症、粒细胞减少及免疫功能低下患者的各种感染；其他感染：乳腺炎、外伤、烧伤及手术后伤口感染、腹腔感染（必要时合用甲硝唑）、胆囊炎、胆管炎、骨与关节感染以及五官科感染等。 结构：

本品主要成份为盐酸安妥沙星，其化学名称为：(S)-(-)-9-氟-2，3-二氢-3-甲基-8-氨基-10-（4-甲基-1-哌嗪基）-7-氧代-7H-吡啶并[1，2，3-de]-[1，4]苯并噁嗪-6-羧酸盐酸盐。 化学结构式：

分子式：C18H21FN4O4 .HCL 分子量：412.8

7.简述液质联用技术的特点及其在药学中的应用。 串联质谱新技术及其在药物代谢研究中

利用MS/MS和LC(GC)-MS/MS等联用技术，不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的分离纯化代谢物样品的工作，而且能分离鉴定以往难于辩识的痕量药物代谢物，从而迅速、方便地解决问题。因此，在探讨药物代谢特征、确定药物代谢物结构及代谢途径与药物及代谢物的药理作用及毒副作用间的

关系，即结构—代谢—活性/毒性三者之间的相关性等药物代谢研究方面，上述质谱联用技术已被开发并显示出非常广阔的应用前景。

MS/MS在药物代谢研究中的应用 3.1 药物代谢物的结构鉴定

由于多数药物的代谢物保留了原药分子的骨架结构，或一些亚结构，因此，代谢物可能进行与原药相似的裂解，丢失一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征离子，用MS/MS分别进行中性丢失扫描、母离子扫描以及子离子扫描，即可迅速找到可能的代谢物，并鉴定出结构。Yost等［8］总结了利用MS/MS鉴定药物代谢物的方法，主要包括以下几个步骤：

1. 测定原药的质谱；

2. 测定原药的子离子谱，选择质子化分子离子、加合离子和主要的碎片离子进行裂解；

3. 选择原药的主要中性丢失测定生物样品的中性丢失谱。图谱中的离子即为原药和可能的代谢物的分子离子； 4. 选择主要的子离子测定生物样品的母离子谱，所得母离子即为各个代谢物。

5. 测定生物样品中所有可能代谢物的子离子谱，解谱得到代谢物的结构。

6. 测定代谢物的子离子谱，选择任一新出现的中性丢失和子

离子重复进行步骤3，4。

Lee等［8］通过成功鉴定一种新的抗癫痫药zonisamide的代谢物，有力证明了该方法的可行性。首先测定zonisamide(MW 212)的正离子化学电离谱，质谱图中给出了很强的质子化分子离子［M+H］+ (m/z 213)，较强的加合离子［M+29］+和［M+41］+，以及少量的碎片离子。［M+H］+离子的子离子谱显示主要的中性丢失81(SO2NH2+H)和主要的子离子［M+H-HSO2NH2］+ m/z 132(图2)。然后分别选择81作中性丢失扫描，选择m/z 132子离子作母离子扫描，测定尿液萃取样品，分别找到m/z 229,259,299和215,255离子，再测定这些离子的子离子谱，根据分子量和裂解特征得到代谢物结构。图2为鉴定得到的代谢物。代谢物A，B是通过中性丢失扫描和子离子扫描推断出的。代谢物C和D是通过母离子扫描和子离子扫描推断出的。 Fig 1 Structure of zonisamide.

Fig 2 Structure of zonisamide metabolites.

由此可以证明，利用母离子扫描、中性丢失扫描以及子离子扫描技术可以快速得到代谢物的大量结构信息，但单独使用这些技术往往是不够的。如图3所示mifentidine代谢物的分析［9］，选择m/z 160离子对原药的微粒体温孵混合物进行母离子扫描，出现离子m/z 188，245，229，分别对应于甲酰胺(M1)、脲代谢物(M2)以及未反应的原药。以前的工作表

明，胺(M3)和N-羟基胺(M4)代谢物都是原药经微粒体温孵产生的，而在m/z 160的母离子扫描中检测不到胺代谢物，同时用该方法也检测不到N-羟基胺化合物的质子化分子离子。因此，在此实验中，使用母离子扫描方式，丢失了微粒体温孵mifentidine产生的两个主要代谢物。特别是N-羟基胺用该方法没有检测到，这是一个很重要的代谢物，因为人们普遍认为这一类代谢物导致芳香胺的毒性，产生诱变和致癌活性。

Fig 3 Structure of mifentidine and its metabolites.

又如：cimetropium bromide(M+=358)体外代谢的研究［9］。原药的子离子扫描谱在m/z 304有一碎片离子，对应于中性丢失。中性丢失扫描()可找到m/z 210，328，340，344，374，390和460离子，均为原药的代谢物，但离子m/z 192，208和238在对照样品中(微粒体经加热失活)也可找到，这些离子经证明是由原药在电离过程中形成的。该实验说明，在反应混合物中存在相对大量未反应原药时，在电离过程中原药可能发生化学反应，如还原和脱水，从而干扰了代谢产物的检测。

从上述例子可以清楚地看到，只采用这些筛选技术研究药物代谢往往不能得到令人满意的结果。研究中可能丢失一些代谢物，如对于进行非一般碰撞诱导裂解的代谢物可能检测不到；对于在非一般活性部位发生代谢转化的代谢物检测不

到；另外，原药还通过电离过程产生非代谢的人工产物，从而干扰代谢物的分析检测。因此，在用串联质谱研究药物代谢时，最好采用与其他手段相结合的方法。

MS用于肽类药物样品制备的目的、要求、特点及分类 药动学定量分析的特点要求在尽量短的时间内正确分析尽可能多的样品。所以，该类研究的生物样品制备总体趋势是尽可能采用高通量的自动化或半自动化处理手段进行。但是，肽类药物的结构、组成、性质与生物基质含有的大量蛋白质和多肽相似甚至相同，故其样品制备过程较合成的小分子药物有所不同，通常要求方法具有更高的灵敏度和选择性。肽类样品制备方法区别于传统的小分子合成药物，由于被分析物无论是组成和结构，还是理化性质均与生物样品的基质蛋白质或多肽相同，这为该类药物的提取、分离和鉴定分析工作带来了极大的挑战。

2 常用的肽类药物样品制备技术的原理和应用

由于肽类分子的物理化学性质介于小分子有机物和大分子蛋白质之间，需充分考虑肽类分子和生物基质的理化性质以选择适当的制备途径。同时，限于目前质谱技术发展的阶段，生物技术药物分析中应用最多的还是相对分子质量较小的多肽类药物。表1总结了近年应用LC．MS联用技术定量分析蛋白质、多肽类药物的部分具有代表性的研究实例。以下

具体先容几种报道较多的肽类药物样品制备方法。 2．1 SPE SPE可以达到初步的往除杂质、脱盐及浓缩被分析物的目的。

随着可用于SPE的材料种类的增加及方便的小型器械的商品化，SPE在小分子及多肽类物质的研究中广泛使用L1引。SPE的原理与柱层析类似，主要包含离子交换和反相色谱机制，洗涤和洗脱可用盐溶液，水、甲醇、乙腈及其不同比例的混合液，也可用环己烷等非极性溶剂洗涤，从而有效往除疏水杂质。Ji等开发了半自动的96孔板SPE提取流程，实现了对相对分子质量为10 4的蛋白质分子的血浆样品提取，且满足临床前研究的要求。文中还指出96孔板SPE形式的主 要上风在于使用圆盘替换层析柱，减少了样品的洗脱体积；与自动化液相处理系统保持了良好的兼容性，从而大大进步了样品制备的通量。自动化的SPE方法结合柱切换技术，使单位临床样本的分析时间小于10 min，并且保持了粗分离和低变异。

2．2 蛋白质沉淀法

蛋白质沉淀法是一种快速的杂质蛋白质往除方法。常用的蛋白质沉淀剂包括乙腈、丙酮、甲醇或乙醇等有机溶剂，高氯酸、三氯醋酸等有机酸，饱和硫酸铵等盐类物质。通常在沉淀蛋

白质后离心，上清层可经挥干、重溶或不作处理直接进样

LC．MS分离分析。具有操纵简单，无需特殊装置等上风。然而，该方法由于沉淀剂的引进，同时产生了对色谱分离和质谱检测步骤的不利因素。首先，由于非特异性的沉淀反应可能使微量的分析物随着基质蛋白质共同沉淀而损失。其次，有机溶剂的引进可能影响后续的液相色谱分离效能，而有机酸和盐类物质则在喷雾电离过程中抑制分析物的离子化效率，大大降低检测灵敏度， Sibylle在利用乙腈沉淀血清蛋白质后发现多肽药物随着沉淀反应而有所损失；Yamaguchi等_在多肽KW-5139的定量研究中使用乙腈沉淀蛋白质后，上清层直接进样分析获得了满足的结果，同时讨论了不同pH值下分析物的多电荷离子分布情况。 2．3 超滤法

选择适当相对分子质量截留的超滤管(1 000～3 000)，可以有效的实现肽类物质富集浓缩和脱盐。但在使用时需留意到药物与生物样品基质的相互作用而降低回收效率。Fierens等直接将尿样进行超滤处理，结合LC-MS成功的分析了尿中C-peptide的含量。 2．4 亲和层析

作为样品制备方法的亲和萃取(affinity extraction)是基于固相化亲和介质与其对应的目标分子特定结构域较强的特异性相互作用，分离复杂生物基质中特定组分的方法。亲和提取法是目前富集效率和专属性最高的样品提取、富集手段之

一。但目前用于肽类药物定量分析研究的文献较少，这主要是由于免疫亲和层析和受体亲和层析等方法的建立造价较高，选择适当亲和力的抗体或配基较难以及反应条件的通用性较差等。Kobayashi等首次报道了利用免疫亲和层析技术提取人降钙素(human calcitonin，hCT)的制备方法，并用于生物样品中hCT 的提取定量分析。Ander—son等 J建立了利用稳定同位素作为内标物，利用抗特定肽段的抗体亲和层析将肽段从复杂的生物体系中提取出来的方法，称作SISCAPA(stable isotope standards and capture by anti．peptide antibodies)同时将此方法成功用于复杂样品中指定蛋白质、多肽的定量分析中。 2．5 其他方法

灌注色谱是近年出现的一种基于分子筛原理与高速活动的活动相的层析分离方法，固定相孔径大小及活动相速度直接影响分离效果。制成的固相萃取柱或液相柱，可以每分钟几十毫升

的高速上样，尤其在生物样品和培养基中蛋白质和肽类的分离、富集和除盐，具有独特上风。Choi等改良了传统的多步灌注色谱法(multistep perfusion chromatography，MSPC)，开发出一步灌注色谱法(single — step perfusion chromatography．SSPC)，并成功用于大鼠肝脏组织等复杂组分的蛋白质组研究中，获得了增强的多肽信号。阻定性进进

介质有两层不同的表面，外层表面通过体积排除作用提供选择性，并仅答应相对分子质量较小的分子进进内表面。内层表面通过传统的分配作用捕捉分析物引。选择适当填料，有看在肽类药物研究中应用。但是，上述两种方法尚未查到在复杂生物样品中蛋白质、多肽的药动学研究的报道。此外，为了适应高通量、自动化处理的要求，集成了多种分离、提取、分析模式的在线处理系统也不断的研制开发并用于复杂生物样品的研究中。在线处理系统包含了诸多符合大规样子容貌品制备或分离的装置，一般较离线方式复杂，且本钱较高。此外，由于分析目标不同，目前还没有通用和成熟的贸易化系统可供给用。