・ｌ】０４・ 色 图１ 葫芦巴碱的化学结构 Ｆｉｇ．１ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｒｉｇｏｎｅｌｌｉｎｅ （ＥＣ） 和核磁共振（ＮＭＲ）” 等。目前咖啡葫芦 巴碱含量测定常用方法为ＨＰＬＣ法。Ｃａｓａｌ等 采 用ＯＤＳ—Ｃ１８柱、甲醇和磷酸缓冲盐梯度洗脱分离咖 ∞ 啡中的葫芦巴碱。Ｆｒａｎｃａ等¨ 采用Ｃ１８柱、甲醇 和乙酸梯度洗脱分离咖啡中的葫芦巴碱。这些方法 大部分采用热水浸提２ ｈ以上，无净化处理，耗时、 污染仪器，不利于日常、大批量样品的检测。 随着国际咖啡企业对云南小粒咖啡品种的认可 并收购其原材料，云南省也投入巨资大力发展咖啡 产业，但尚欠缺科学系统的质量控制与综合评价体 系。本文建立了简单、快速测定咖啡中葫芦巴碱的 地方标准，对云南省咖啡豆原料及其制品的质量控 制、资源合理开发利用具有重要的指导意义。 １ 实验部分 １．１仪器及试剂 Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５型高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ公 司），配四元泵溶剂淋洗系统、自动进样系统、２４８７ 紫外检测器；ＨＢ５０型超声波萃取仪（功率５０ ｗ，频 率４０ ｋＨｚ，容量２ Ｌ，南京莱步科学器材公司）； ＨＳ２０５００Ｄ型超声波萃取仪（可选三档，最大功率 ５００ Ｗ，频率４０ ｋＨｚ，容量２０ Ｌ，天津恒奥科研有限 公司）；Ａｒｉｕｍ ６１ １ＤＩ型纯水器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）。 标准品和试剂：葫芦巴碱（纯度９８％），中国生 物药品检定所研制。色谱纯甲醇（Ｆｉｓｈｅｒ公司），醋 酸锌、亚铁、磺基水杨酸均为分析纯（国药集 团化学试剂有限公司）。 通过企业送检方式收集焙烤咖啡粉和速溶咖啡 样品各５份，均为云南小粒咖啡。将样品于常温下 保存。 １．２ 色谱条件 色谱柱：ＢｏｎｄＰａｋ ＮＨ，（２５０ ｎｌｍ×４．６ ｍｍ，５ ｍ；Ｗａｔｅｒｓ公司）；流动相：甲醇一水（８２：１８，ｖ／ｖ）， 柱温：３０℃；流速：０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长：２６０ ｎｍ； 进样量：１０ Ｌ。 １．３标准曲线 精密称取葫芦巴碱标准品ｌ０ ｍｇ，置于ｌ０ ｍＬ 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，得葫芦巴 碱贮备液１ ０００ ｍｇ／Ｌ。用水将其分别稀释为１、４、 谱 第２９卷 １０、２０、４０ ｍｇ／Ｌ系列质量浓度的标准溶液。分别取 １０ Ｌ进样测定，以葫芦巴碱的峰面积对其质量浓 度作标准曲线。 １．４超声萃取样品前处理 精密称取０．５ ｇ咖啡样品，置于２５０ ｍＬ锥形瓶 中，加入８０ ｍＬ水，室温下超声萃取５ ｍｉｎ，滤纸过 滤，加入１ ｍＬ ５％磺基水杨酸溶液于滤液中，摇匀， 转移定容于１００ ｍＬ容量瓶中，经０．４５／，ｍ滤膜过 滤，滤液供ＨＰＬＣ分析。 １．５热浸提样品前处理 参照文献［６，８，ｌ５］的方法，精密称取０．５ ｇ样 品，置于２５０ ｍＬ锥形瓶中，加入８０ ｍＬ热水（沸 腾），于８０℃水浴中萃取２ ｈ，过滤，冷却后加入ｌ ｍＬ ５％的磺基水杨酸于滤液中，摇匀，转移定容于 １００ ｍＬ容量瓶中，经０．４５ ｍ滤膜过滤，滤液供 ＨＰＬＣ分析。 ２结果与讨论 ２．１超声萃取时间的优化 试验在ＨＢ５０超声波萃取仪的功率（５０ ｗ）和 频率（４０ ｋＨｚ）固定条件下，比较不同的超声萃取时 间（０～３０ ｍｉｎ）时葫芦巴碱的提取率，每个试验重 复３次。由于葫芦巴碱的水溶性好，超声萃取前 ７６％的葫芦巴碱能溶解于水。萃取时问在５～３０ ａｒｉｎ内，葫芦巴碱萃取率的变化值小于１％，因此５ ｍｉｎ能完全萃取葫芦巴碱。 ２．２ 超声波功率对萃取葫芦巴碱的影响 在ＨＳ２０５００Ｄ超声波萃取仪的频率设定为４０ ｋＨｚ，功率分别设定为１２５、２５０和５００ Ｗ条件下，分 别对咖啡样品进行３０ Ｓ、１ ｍｉｎ、２ ｒａｉｎ和３ ｍｉｎ的萃 取。在１２５ Ｗ下萃取３ ｍｉｎ，葫芦巴碱的萃取率可 达９７％；在５００ Ｗ下萃取１ ｍｉｎ，葫芦巴碱萃取率可 达９８％。结果表明，超声波功率大，短时间内萃取效 率高。本实验选择在ＨＳ２０５００Ｄ超声波萃取仪最大 功率（５００ Ｗ）下进行萃取。 ２．３蛋白质沉淀剂的选择 由于速溶咖啡中蛋白质较多，萃取液混浊，经滤 纸过滤后直接用０．４５ ｍ的滤膜很难过滤，需净化 处理。比较了５％磺基水杨酸和１０％醋酸锌＋１０％ 亚铁混合溶液对咖啡中蛋白质的沉淀作用。 通过加标试验可知，在经滤纸过滤后的萃取液中加 入１ ｍＬ １０％醋酸锌＋１ ｍＬ １０％亚铁沉淀 剂，葫芦巴碱的回收率为０；加入１ ｍＬ ５％磺基水杨 酸沉淀剂，葫芦巴碱的回收率为９４％。进一步试验 表明，在咖啡粉的萃取液中加入磺基水杨酸沉淀剂， 色 表２ 日间测定葫芦巴碱含量的重复性 Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｒｉｇｏｎｅｌｌｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎ ｉｎｔｅｒｄａｙ ｔｅｓｔ 表３ 不同人员测定葫芦巴碱含量的重复性 Ｔａｂ ｅ ３ Ｒｅｐｅａｔａｂ ｉｔｙ ｏｆ ｔｒ ｇｏｎｅｌ¨ｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｗｏ ａｎａ１） ｓｔｓ ＲＳＤ：ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ；ＲＤ：ｒｅｌａｔｉｖｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ． ２．８回收率试验 在已知葫芦巴碱含量的咖啡粉（或速溶咖啡） 中分别加入１．０、２．０、４．０ ｇ／ｋｇ（或０．２、０．４、０．８ ｇ／ｋｇ）３个含量水平的葫芦巴碱，每个添加水平样 品重复测定５次，计算回收率。从结果（见表４）可 知，所有样品中葫芦巴碱的加标回收率大于９０％以 上，ＲＳＤ≤３．０１％。 表４咖啡样品中葫芦巴碱的加标回收率（ ＝５） Ｔａｂｌｅ ４ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｔｒｉｇｏｎｅｌｌｉｎｅ ｓｐｉｋｅｄ ｉｎ ｃｏｆｆｅｅ ｓａｍｐｌｅｓ（ｎ：５） 谱 第２９卷 ２．９ 咖啡粉和速溶咖啡样品的测定 经测定，云南焙烤咖啡中葫芦巴碱的含量范围 为２．３５～４．２１ ｇ／ｋｇ，是巴西焙炒咖啡中葫芦巴碱含 量 的１／２，说明云南省咖啡加工工艺导致葫芦巴 碱的损失大；速溶咖啡中葫芦巴碱的含量范围为 ０．２８７～０．５２４ ｇ／ｋｇ，比焙烤咖啡中葫芦巴碱的含量 低一个数量级。因此，要品尝咖啡特殊的香气、口 感，最好饮用焙烤咖啡。 ３ 结语 采用超声波萃取咖啡中的葫芦巴碱能缩短分析 时问，提高分析效率；用ＮＨ 柱分离葫芦巴碱可以 弥补反相Ｃ１８柱对葫芦巴碱吸附弱、柱效低等弱 点。准确度和精密度试验结果表明该方法准确可 靠，可以用于例行和大量样品的分析检测工作。 参考文献： ［１］Ｋｙ Ｃ Ｌ，Ｌｏｕａｒｎ Ｊ，Ｄｕｓｓｅｒｔ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００１，７５： ２２３ ［２］Ｌａｎｇ Ｒ，Ｗａｈｌ Ａ，Ｓｔａｒｋ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌ Ｎｕｔｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ，２０１１， ｄｏｉ：ｌ０．１００２／ｍｎｆｒ．２０１０００６５６ ［３］Ｏｌｔｈｏｆ Ｍ Ｒ，ｖａｎ Ｄｉｊｋ Ａ Ｅ，Ｄｅａｃｏｎ Ｃ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｎｕｔｒ Ｍｅｔａｂ， ２０１１，８：１０ ［４］Ｂａｋｕｒａｄｚｅ Ｔ，Ｌａｎｇ Ｒ，Ｈｏｆｍａｎｎ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌ Ｎｕｔｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ，２０１０，５４：１７３４ ［５］Ｈｉｒａｋａｗａ Ｎ，Ｏｋａｕｃｈｉ Ｒ，Ｍｉｕｒａ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏ— ｃｈｅｍ，２００５ ６９：６５３ ［６］ Ｃａｓａｌ Ｓ，Ｏｈｖｅｉｒａ Ｍ Ｂ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ Ｍ Ａ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２０００， ６８：４８１ ［７］Ｋｎｏｐｐ Ｓ，Ｂｙｔｏｆ Ｇ，Ｓｅｌｍａｒ Ｄ．Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈ，２００６， ２２３：１９５ ［８］ Ｏｏｓｔｅｒｖｅｌｄ Ａ，Ｖｏｒａｇｅｎ Ａ Ｇ Ｊ，Ｓｃｈｏｌｓ Ｈ Ａ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙ，２００３，５４：１８３ ［９］Ｂｒｕｇｇｉｎｋ Ｃ，Ｍａｕｒｅｒ Ｒ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ，２００５，１０８５：１０４ ［ＩＯ］Ｐｅｒｒｏｎｅ Ｄ，Ｄｏｎａｎｇｅｌｏ Ｃ Ｍ，Ｆａｒａｈ Ａ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００８， １１０：１０３０ ［１１］Ｌａｎｇ Ｒ，Ｗａｈｌ Ａ，Ｓｋｕｒｋ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２０１０，８２ （４）：１４８６ ［１２］ Ｚｈｕｏ Ｒ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｗａｎｇ Ｌ ｘ，ｅｔ ａ１．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（卓荣杰，王莉，王龙星，等，色谱）， ２０１０，２８（４）：３７９ ［１ ３］ Ｓ６ｎｃｈｅｚ—Ｈｅｒｎ￣ｎｄｅｚ Ｌ，Ｐｕｃｈａｌｓｋａ Ｐ，Ｇａｒｃｉａ—Ｒｕｉｚ Ｃ，ｅｔ ａ１． Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２０１０，５８（１３）：７４８９ ［１４］ｄｅｌＣａｍｐｏ Ｇ，ＢｅｒｒｅｇｉＩ，ＣａｒａｃｅｎａＲ，ｅｔ ａ１．Ｔａｌａｎｔａ，２０ｌ０， ８１：３６７ ［１５］Ｆｒａｎｃａ Ａ Ｓ，Ｍｅｎｄｏｎｃ Ｊ Ｃ Ｆ，Ｏｌｉｖｅｉｒａ Ｓ Ｄ．ＬｗＴ—Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ，２００５，３８：７０９
